一种高纯度雷莫拉宁单组份的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种利用游动放线菌(Actinoplanessp.)发酵培养物制备雷莫拉宁三种单组份的制备方法。该方法包括将雷莫拉宁发酵液通过大孔脱色树脂脱色后，再用大孔吸附树脂吸附、解吸，浓缩后得到含有三种单组份A1、A2、A3的雷莫拉宁粗提物。对粗提物再用溶剂溶解后借助聚合物微球进行层析分离，得到高纯度的雷莫拉宁三种单组份A1、A2及A3产品。本发明专利技术的优点在于使用聚合物微球对该产品进行层析分离时，样品处理量大，得到的单组份纯度高。因聚合物微球介质的价格为反相硅胶C18的30%，且分离效果相当，从而大大降低了制备成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于工业微生物
，涉及药品原料的制备方法，具体地说涉及到一种从发酵培养物中分离纯化雷莫拉宁三种单组份的制备方法。
技术介绍
许多临床严重感染的病源菌是革兰氏阳性菌。由于抗生素的大量使用，细菌耐药性问题日趋突出。寻找新的糖肽类抗生素逐渐成为医药行业迫切的需要。目前，已有几种具有很好前途的新型抗生素正处于开发阶段，雷莫拉宁便是其中之一。雷莫拉宁单组份Al、A2和A3的结构式如下 WOHO Iψ J| ；广、II ,气 r H X .—4—又 X 义义、I λ Η’i-才. Γ h5 I h ο …― \ hi / \\ \乂之‘尸5、4 I - S H I I - ζH j jTΛH、 Ji.X ,i广HAA.L >Λ、，'—-、‘...J--'1-、Γ., ' Wr1 ■ ,j I ^ I rt I K ;fΓ Γ ft in, L β、Jl^'γ·-- .π λ >為At*组份IrI分子量 Al_-CO-CH=CH-CH=CH-CH2-CH2-CH2_2540Α2~ -CQ-CH=CH-CH=CH-CH2-CH (CH3) 22555A3 I-CO-CH=CH-CH=CH-CH2-CH2 二 CH (CH3) 2丨2568雷莫拉宁(Ramoplanin、A16686、MDL62198)是一种从游动放线菌 iActinoplanes sp.)培养液中分离出的由17个氨基酸组成的一种新型的糖肽类抗生素，主要抑制革兰氏阳性菌的生长。其纯品是由Al、A2、A3三个组份组成的混合物，其中A2为主要成分，占80%。雷莫拉宁能够特异而迅速地抑制革兰氏阳性菌细胞壁的生物合成。这种抑制作用与万古霉素(Vancomycin)和替考拉宁(Teicoplanin)的抑菌机制不同。体外试验表明，雷莫拉宁对葡萄球菌的抑菌率是万古霉素和替考拉宁的4 8倍，而对链球菌、肠球菌、棒状杆菌、梭菌等多种革兰氏阳性菌都有很强的抑菌活性。另外，雷莫拉宁对许多具有耐药性的病原菌有很好的抑菌效果。雷莫拉宁的细胞毒性较小且无交叉耐药问题。但因其分子量较大，故胃肠道难于吸收，目前雷莫拉宁主要开发为外用药物。雷莫拉宁在治疗痤疮、感染性外伤以及腹泻感染等病症上已取得了良好的效果，并且已进入了临床试验。美国专利US5491128报道了将雷莫拉宁粗提物溶解后，用硅胶柱吸附。然后依次用不同浓度的酸水和乙腈梯度洗脱，分别得到A2及A3。再用半制备色谱分离，得到Al单组份。该方法存在以下缺点(1)滤液未经脱色除杂，直接得到粗提物，含杂质较多，对下游纯化介质造成的损伤大；(2)硅胶柱层析用不同浓度的酸水和乙腈梯度洗脱，水会造成硅胶层析能力下降，再生后才能重复使用，无法实现规模化生产。中国专利CN200610024152和美国专利US4427656公开了雷莫拉宁单组份的制备方法，所用的分离介质都是C18反相硅胶。该介质价格昂贵，每升售价达到I万元以上，制备成本很高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述不足之处，研究设计一种制备高纯度、低成本的雷莫拉宁单组份的制备工艺。本专利技术首次采用聚合物微球分离纯化发酵液粗提物，介质的成本 是C18反相硅胶的30%，且分离效果相当。以聚合物微球为分离介质，通过梯度解析，有效地去除了发酵代谢过程中产生的杂质，得到高含量的雷莫拉宁Al、A2和A3单组份，含量大于98. 0%，总收率大于70%，适于工业化规模生产高纯度雷莫拉宁Al、A2和A3单组份。下面对本专利技术进行具体描述 本专利技术的目的是这样实现的在雷莫拉宁发酵液中加入助滤剂，搅拌均匀，过滤，脱色，吸附、解吸、浓缩得到粗提物；粗提物用极性溶剂溶解后上样至聚合物微球层析柱，使用水与极性溶剂的混合液梯度解析，高压液相色谱仪(以下简称HPLC)在线检测，分别收集雷莫拉宁A1、A2和A3洗脱液，经浓缩、结晶、干燥，分别得到高纯度雷莫拉宁A1、A2和A3单组份精粉。本专利技术所得雷莫拉宁可供药品使用。雷莫拉宁单组份A1、A2和A3含量可达98. 0%以上,样品回收率大于70%。具体地，本专利技术涉及一种高纯度雷莫拉宁单组份Al、A2和A3的制备方法，包括下述步骤 1)常温条件下在雷莫拉宁发酵液中加入助滤剂，搅拌50分钟-I.5小时至助滤剂分散均匀，过滤，固液分离得到雷莫拉宁滤液； 2)滤液使用大孔脱色树脂脱色； 3)脱色液导入大孔吸附树脂进行吸附，饱和树脂用解吸剂解吸，得到解吸液； 4)解吸液浓缩得到雷莫拉宁粗提物； 5)将雷莫拉宁粗提物用极性溶剂溶解，注入聚合物微球层析柱； 6)使用不同浓度的极性溶剂水溶液进行梯度洗脱，收集雷莫拉宁洗脱液； 7)洗脱液浓缩、结晶，固液分离得到雷莫拉宁精粉。其中，步骤I)中调节发酵液中加入的助滤剂为珍珠岩或硅藻土，优选为珍珠岩，助滤剂的用量为每升发酵液加入助滤剂O. 01-0. I千克，优选为O. 02-0. 04 (克/升)；搅拌时间为50分钟-I. 5小时。步骤2)中的大孔脱色树脂为D151、SDA-7、LX-700、D290、D309、D301树脂，优选为D290 或 LX-700 树脂。步骤3)中的大孔吸附树脂为DM130、HZ816、D71、D312、AB-8、DlOl树脂，优选为D312树脂及HZ816树脂，解吸剂为甲醇或乙醇的水溶液，优选为乙醇的水溶液。步骤4)所述的浓缩为30°C -50°C条件下，优选为30_40°C，将解吸液真空浓缩至雷莫拉宁浓度100g/L-120g/L，得到雷莫拉宁粗提物。步骤5)中使用的聚合物微球是采用聚苯乙烯、聚丙烯酸酯及其衍生物制备的，优选氨基化聚苯乙烯微 球、磺酸化聚苯乙烯微球及羧基化聚苯乙烯微球。步骤6)中的极性溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈中的一种。步骤6)中梯度洗脱的极性溶剂水溶液的体积百分比浓度为25-50%。步骤7)所述的结晶，结晶析出溶剂可以是乙酸乙酯或丙酮中的一种，优选为乙酸乙酯，析出溶剂加入量与结晶液体积之比为2:1-10:1，优选为3:1-8:1，结晶液过滤后真空干燥，得到白色的雷莫拉宁三种单组份Al、A2及A3精粉。本专利技术所得产品可供药品使用，雷莫拉宁三种单组份Al、A2及A3的HPLC含量大于98. 0%，样品提取总收率大于70%。本专利技术有如下优点1.通过在发酵液中加入助滤剂，然后进行固液分离，可有效去除其中的菌丝体、未用完的培养基、杂蛋白和金属离子，提高了过滤速度，缩短了工艺周期，并得到澄清的滤液。2.大孔脱色树脂及吸附树脂的应用，去除了大部分色素和极性大的杂质，提高了滤液的澄清度和质量。3.解吸过程采用非连续梯度解吸法，低浓度的乙醇冲洗树脂柱可除去树脂吸附上的大部分多糖、色素和强极性杂质，之后采用高浓度的乙醇解吸，解吸液质量大幅提高。4.首次使用聚合物微球层析，大幅度提高了产品纯度。5.工艺简洁，溶媒消耗量少，溶媒易回收，样品收率高，全程总收率达到70%以上，提取成本低，适用于工业化生产。6.质量可控，为生产药用级原料提供了更加安全的技术保障。附图说明图I :雷莫拉宁的粗提物液相色谱图 图2 :雷莫拉宁Al单组份的液相色谱图 图3 :雷莫拉宁A2单组份的液相色谱图 图4 :雷莫拉宁A3单组份的液相色谱图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种雷莫拉宁单组份的制备方法，包括下述步骤：1）常温条件下，在雷莫拉宁发酵液中加入助滤剂，搅拌50分钟？1.5小时至助滤剂分散均匀，过滤，固液分离得到雷莫拉宁滤液；2）滤液使用大孔脱色树脂脱色；3）脱色液导入大孔吸附树脂进行吸附，饱和树脂用解吸剂解吸，得到解吸液；4）解吸液浓缩，得到雷莫拉宁粗提物；5）将雷莫拉宁粗提物用极性溶剂溶解，注入聚合物微球层析柱；6）使用极性溶剂与水的混合液进行梯度洗脱，高效液相色谱仪（以下简称为HPLC）在线监测，分别收集HPLC含量大于95%的雷莫拉宁单组份A1、A2及A3洗脱液；7）洗脱液分别浓缩、结晶，固液分离得到雷莫拉宁单组份粉末A1、A2及A3。

【技术特征摘要】
1.一种雷莫拉宁单组份的制备方法，包括下述步骤 1)常温条件下，在雷莫拉宁发酵液中加入助滤剂，搅拌50分钟-I.5小时至助滤剂分散均匀，过滤，固液分离得到雷莫拉宁滤液； 2)滤液使用大孔脱色树脂脱色； 3)脱色液导入大孔吸附树脂进行吸附，饱和树脂用解吸剂解吸，得到解吸液； 4)解吸液浓缩，得到雷莫拉宁粗提物； 5)将雷莫拉宁粗提物用极性溶剂溶解，注入聚合物微球层析柱； 6)使用极性溶剂与水的混合液进行梯度洗脱，高效液相色谱仪(以下简称为HPLC)在线监测，分别收集HPLC含量大于95%的雷莫拉宁单组份Al、A2及A3洗脱液； 7)洗脱液分别浓缩、结晶，固液分离得到雷莫拉宁单组份粉末Al、A2及A3。2.根据权利要求I所述的方法，其中步骤I)所述的助滤剂为珍珠岩或硅藻土，助滤剂的用量为每升发酵液加入助滤剂O. 01-0. I千克。3.根据权利要求I所述的方法，其中步骤2)所述大孔脱色树脂为D1...

【专利技术属性】
技术研发人员：段宝玲，张雪霞，李宁，李晓露，任风芝，陈书红，成晓迅，林毅，王海燕，李丽红，张金娟，林旸，张丽，张艳立，高月麒，张艳哲，蒋沁，董爱华，
申请(专利权)人：华北制药集团新药研究开发有限责任公司，
类型：发明
国别省市：