本发明专利技术公开了属于免疫学诊断技术领域的一种类风湿关节炎的抗原表位及其应用。该抗原表位为多肽，其氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO:?1所示。该抗原表位多肽，通过ELISA检测与患者血清的反应情况，表明其能特异的与患者血清中的IgG结合，而不与健康人血清反应。该抗原表位多肽可制备诊断类风湿关节炎的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫学诊断
，具体涉及一种类风湿关节炎的抗原表位及其应用。
技术介绍
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以关节滑膜炎症和骨破坏为病理基础的全身性自身免疫病，在我国的患病率为0. 34%，国内有500万以上RA患者，且多 为青壮年劳动力，是严重危害人类健康的主要致残性疾病。迄今为止，本病的发病机制尚不清楚，治疗主要为非特异性对症治疗，暂时缓解和改善病情，而不能从根本上控制滑膜炎症的发生和骨破坏的进展。 近年来提出了对RA诊断具有高特异性的瓜氨酸相关自身抗体系统，包括AKA、APF、AFA、抗CCP抗体，并认为抗Sa抗体亦属于此系统，也有人称他们为RA早期诊断抗体谱，这些抗体对早期RA诊断具有较好的特异性。因此，寻找一种敏感性强、特异性高而又简便易行的血清学检测方法，对类风湿关节炎的早期诊断及治疗具有重要意义。大量自身抗体的出现是自身免疫性疾病的重要特征之一，但由于其发病机制尚不明确，难以直接利用自身抗原检测抗体。抗原表位(epitope)是抗原分子中识别、结合抗体的基础，因此是检测抗体的实际有效组分。以抗原表位肽或其模拟肽(mimotope)作为诊断工具有以下几个优势1)可以提高诊断的灵敏度和特异性，避免了生物大分子易产生的非特异性结合(Deroo S et al (2001) Comb Chem High Throughput Screen 4: 75 - 115)；2)扩大疾病诊断的范围，对于研究较少或难以体外应用的自身抗原如核酸抗原、多糖抗原、脂类抗原，以模拟肽作为天然抗原的替代物进行诊断，也可以获得与天然抗原表位一致的结果(Bruce G (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94 :1955 - 1960 ； Jinaping Q et al(1999) Hyridoma 18(1):103 - 109);3)多肽制备、应用的成本低、易于质控。因此，自身抗原表位肽或其模拟肽(Meloen RH et al (2000) J Mol Recognit 13: 352 - 359 )的获得是制备自身抗体的多肽检测试剂的基础。基于噬菌体肽库技术的抗原表位确定技术，仅需要以患者血清样本为靶标，而无需天然的自身抗原信息，可以实现快速和简便筛选，并且成本低、结果可信度高。噬菌体肽库技术的另一个突出特点是，通过筛选可以同时获得某一疾病特异性的多个抗原表位肽，它们可能代表了天然抗原的主要免疫显性基团。天然生物大分子抗原通常由多个抗原表位组成，其中有一些在免疫反应中起着主要作用，被称为“免疫显性基团”，针对完整抗原的抗体主要是针对这些表位的多种“单克隆抗体”组成。以RA患者血清样品为靶标，通过噬菌体肽库筛选，获得RA特异性的抗原表位肽，是获得新型诊断试剂的基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种类风湿关节炎的抗原表位。本专利技术的目的还在于提供上述抗原表位的核苷酸序列。本专利技术的目的还在于提供一种检测类风湿关节炎的试剂盒。本专利技术的目的还在于提供类风湿关节炎的抗原表位在制备诊断类风湿关节炎的药物中的用途。专利技术人从10例RA患者血清中制备和纯化得到IgG，然后以线性十二肽库与抗体孵育，经筛选获得了与抗体特异结合的噬菌体克隆。之后通过ELISA确定阳性噬菌体克隆，测定阳性噬菌体克隆展示肽序列。化学合成其中的一个表位肽，命名为RAP，通过ELISA检测与患者血清的反应情况,表明其能特异的与患者血清中的IgG结合,而不与健康人血清反应。一种类风湿关节炎的抗原表位，该抗原表位为多肽，其氨基酸序列如序列表SEQID NO: I 所示。 编码上述类风湿关节炎的抗原表位的核苷酸序列。一种检测类风湿关节炎的试剂盒，该试剂盒包括权利要求I所述多肽，权利要求I所述多肽的抗体，固相酶标板，牛血清白蛋白，辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，四甲基联苯胺。所述类风湿关节炎的抗原表位在制备诊断类风湿关节炎的药物中的用途。本专利技术的有益效果本专利技术获得的类风湿关节炎的抗原表位多肽，通过ELISA检测与患者血清的反应情况，表明其能特异的与患者血清中的IgG结合,而不与健康人血清反应。附图说明图I为阳性噬菌体克隆的ELISA结果。图2为RAP与RA患者血清样品、健康人血清样品的结合。图3为RAP抗体检测的ROC曲线。具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步说明。以下实施例并不限定本专利技术，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书。实施例I RA患者血清总IgG制备和纯化取适量Protein A树脂悬液(GE公司产品)，装入层析柱，用10倍柱体积的PBS缓冲液洗涤平衡层析柱。将类风湿关节炎患者血清高速离心后，加入1/10体积10XPBS缓冲液混合，调整PH以及离子浓度后，缓慢加入层析柱。用10倍柱体积以上的PBS洗涤，至流出液无蛋白检出。加入6倍柱体积0.1 M甘氨酸(pH 3.0)洗脱，收集穿出液，以1/10体积的IM Tris-HCl (pH 9.0)中和。将得到抗体对PBS透析，定量抗体浓度后加入50%甘油，分装并保存在_20°C。实施例2 噬菌体展示肽库筛选RA特异性的抗体结合肽Ph.D.-12肽库试剂盒购自NEB公司，库容量为2. 7X109，滴度为1.5X1013/ill.。Escherichia coli ER2537为肽库的宿主菌。筛选过程参见噬菌体展示肽库试剂盒使用说明书。每轮筛选以RA患者血清中的总IgG包被(每孔10 yg)，每孔投入IX IO11噬菌体。噬菌体富集程度通过“投入/产出比”计算。经过三轮筛选，挑取阳性克隆测序。阳性噬菌体克隆与总IgG抗体的特异性结合通过ELISA测定。总IgG抗体(每孔10 ii g)包被96孔板(Nunc公司)4 °C过夜。倾去不结合的抗体，3% BSA 37°C封闭I小时。每孔投入I X IO9噬菌体37°C孵育2小时。洗涤液(PBS-0. 05% Tween 20)洗板5次，共3分钟。HRP标记的抗M13单抗(1:1000稀释，Amersham Biosciences公司)37°C孵育I小时。洗漆方法同上，以TMB (Sigma)为底物检测结合的抗M13单抗，450 nm检测光吸收，结果见图I。由图I可知，这14个克隆均为阳性克隆。序列测定结果表明，这些序列具有良好的一致性，其中一条序列出现频率高、保守性好。申请人据此合成了该肽段，其具体的氨基酸序列为FKSGTGPQQYSY (SEQ ID NO 1),命名为 RAP。实施例3 RAP与RA患者血清IgG结合检测合成肽RAP (每孔0. 5 ii g)包被96孔板(Nunc公司)4 °C过夜。倾去不结合的 肽，3% BSA 37°C封闭I小时。RA患者或健康人血清样品1:400稀释，加入不同孔中，37°C孵育I小时。洗涤液(PBS-0. 05% Tween 20)洗板5次，共3分钟。1:1000稀释的HRP标记的羊抗人IgG 37°C孵育I小时。洗涤方法同上，以四甲基联苯胺(TMB，Sigma)为底物检测结合的抗M13单抗,450 nm检测光吸收。结果本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种类风湿关节炎的抗原表位，其特征在于，该抗原表位为多肽，其氨基酸序列如序列表SEQ？ID？NO:？1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨光，栗占国，高亚萍，柳川，穆荣，董洁，刘玉，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，北京大学人民医院，
类型：发明
国别省市：
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