一种昆嵛林蛙改造体抗菌肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，具体地说是一种昆嵛林蛙（Rana?kunyuensis抗菌肽Kunyuenin改造体抗菌肽Kunyuenin-3及其制备方法和应用。改造体抗菌肽为昆嵛林蛙（Rana?kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体Kunyuenin-3，其是直链多肽，含有14个氨基酸残基，分子量1587.97Da，等电点8.96。本发明专利技术改造抗菌肽Kunyuenin-3具有极强的抗氧化活性，此外具有分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简单等有益特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学
,具体地说是ー种昆箭林娃(Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体抗菌肽Kunyuenin-3及其制备方法和应用。
技术介绍
自由基指任何包含ー个未成对电子的原子或原子团。生物体与外界接触和自身产生的自由基主要是活性氧自由基，包括超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢、脂质过氧自由基、ニ氧化氮、一氧化氮自由基、单线态氧和臭氧。在较高浓度下，活性氧自由基对生物细胞的细胞结构、核酸、脂类和蛋白质造成损伤。造成DNA损伤，进一歩引起复制错误、基因组不稳定、转录意外起始或终止，从而导致生物体变异或疾病发生；引起细胞膜流动性和通透性改变，导致细胞结构和功能改变；引起蛋白质氧化，导致蛋白质变性和失活。·目前发现，活性氧自由基与多种人类疾病有关,如癌症、心脑血管疾病、缺血再灌注损伤、类风湿性关节炎、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病和衰老等。为了抵抗活性氧自由基对机体的损害，在漫长的进化过程中生物体形成多种不同的自由基清除系统，包括非基因编码的小分子物质，如尿酸、维生素C、维生素E、胡萝卜烯类、硫辛酸和辅酶Q等；基因编码的大分子抗氧化酶类，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、过氧化物酶、硫氧还蛋白酶系统和谷胱甘肽酶系统；基因编码的小分子抗氧化肽类，如从两栖类蛙科动物皮肤中发现的各种小分子抗氧化多肽。各种不同类型的自由基清除剂在医药和化妆品领域具有极大的应用潜力，如维生素C、超氧化物歧化酶(SOD)和小分子抗氧化多肽。昆箭林娃(Rana kunyuensis)属于两栖纲无尾目娃科娃属，为中国特有种,仅分布于山东省烟台市昆嵛山。目前关于昆嵛林蛙形态、发育和分子进化已有报道，但是关于昆嵛林蛙来源抗氧化多肽的研究还没有报道。
技术实现思路
本专利技术的目在于ー种昆箭林娃(Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体抗菌肽Kunyuenin-3及其制备方法和应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为ー种昆箭林娃改造体抗菌肽，改造体抗菌肽为昆箭林娃(Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体Kunyuenin-3,其是直链多肽，含有14个氨基酸残基，分子量1587. 97Da，等电点 8. 96。所述改造体抗菌肽为苯丙氨酸一売氨酸ー脯氨酸一苯丙氨酸一苯丙氨酸ー丙氨酸一丙氨酸一半胱氨酸一丙氨酸ー异亮氨酸一苏氨酸一精氨酸ー赖氨酸一半胱氨酸。改造体抗菌肽的应用，所述所述的改造体抗菌肽用于制备抗氧化药物或化妆品添加剂的用途。本专利技术的有益效果在于本专利技术根据昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的氨基酸序列，利用分子改造方法设计Kunyuenin的改造体Kunyuenin-3,该改造体具有极强的抗氧化活性，此外具有分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简单等有益特点。具体实施例方式下面用实施例来进ー步说明本专利技术的实质性内容，但本专利技术的内容并不局限于此。实施例I昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin基因克隆I)昆嵛林蛙皮肤总RNA提取①取300mg昆嵛林蛙皮肤组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中，加入Iml总RNA提取缓冲液(Trizol,美国Invitrogen公司产品)，充分混勻，而后于4°C,12000rpm 离心 lOmin。②离心取上清，加入0. 2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4°C，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4°C，12000rpm离心10分钟，收集沉淀用75% (V/V)こ醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为昆嵛林蛙皮肤总RNA。2)昆嵛林蛙皮肤cDNA文库构建采用CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit。(I) cDNA第一链合成(mRNA反转录):①经DEPC处理(DEPC处理是在含0. I % (V/V) DEPC的水浸泡过夜，高压灭菌，烘干)的离心管中加入Iul昆箭林娃皮肤总RNA、1 ii I 3’端一链合成引物(3’ In-FusionSMARTer CDS Primer)和 2. 5 y I DEPC 处理的水(DEPC 处理的水是含 0. I % (V/V) DEPC 的水，放置过夜，高压灭菌)使总体积达到4. 5iU，混匀后短暂离心(2000rpm，30s)，离心后于72°C保温3分钟；保温后再将离心管在42°C孵育2分钟。 ②在上述离心管中加入以下试剂(均为CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建库试剂盒中配备),2. 0 u I 5X 第一链缓冲液、0.25iil IOOmM DTTU. Ou I IOmM dNTPMixU. Ou I SMARTer V Oligonucleotide、0. 25 u I RNase Inhibitor 和 I. Ou I SMARTScribe Reverse Transcriptase反转录酶，混合离心管中试剂并短暂离心(2000rpm,30s),在42°C保温90min,然后68°C保温lOmin。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2 Ul所合成的cDNA第一链备用。(2)采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链(所用试剂均为CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建库试剂盒中配备)①将2 ul cDNA 第一链(mRNA 反转录)、80 U I 去离子水、10 U I IOXAdvantage2PCR 缓冲液、2iil 50 XdNTP 混合物、2 ii I 5’PCR 引物、2yl CDS III/3’PCR 引物以及 2 y I50 X Advantage 2 Polymerase Mix 在 95°C预热的 PCR 管中进行混合。②在PCR 仪中按以下程序扩增95°C，lmin ; 18 个循环95°C，15sec，65°C，30sec，68°C，6min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链ー 80°C保存。(3)昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin基因克隆筛选根据蛙科抗菌肽信号肽区保守序列设计正向引物进行PCR扩增，其序列为 5’ -CCAAAGATGITCACCTTGAAG-3’，PCR 另ー扩增引物为 CL0NTECH 公司 In-FusionSMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 中的 3，-PCR 引物，其序列为5’ -CGGGGTACGATGAGACACCAT-3’。PCR 反应在如下条件下进行94°C 4min，94°C 30sec,57 °C 30sec和72°C lmin,30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物)进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到PMD19-T载体(Takara，大连)，转化进CaCl2-MgCl2法制备好的DH5 a感受态细胞。涂板并进行氨苄本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种昆嵛林蛙改造体抗菌肽，其特征在于：改造体抗菌肽为昆嵛林蛙（Rana？kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体Kunyuenin？3，其是直链多肽，含有14个氨基酸残基，分子量1587.97Da，等电点8.96。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王义鹏，于海宁，秦松，
申请(专利权)人：中国科学院烟台海岸带研究所，
类型：发明
国别省市：