本发明专利技术属于分离材料领域，具体为一种蛋白质分子印迹分离介质的制备及使用方法。在硅胶、高分子等基质表面通过物理或化学的方法连接模板蛋白质分子，进一步采用部分包埋技术将与基质表面结合的蛋白质部位包埋。清洗掉部分包埋不牢固的蛋白质，剩余的蛋白质将漂浮在基质表面，并与基质表面的印迹点一起实现立体印迹效应。这种蛋白质印迹分离介质可以对模板蛋白质进行高选择性分离。本发明专利技术的优点为分离材料制备简单、选择性好。
【技术实现步骤摘要】
一种立体漂浮蛋白质分子印迹色谱固定相的制备及使用方 法
本专利技术属于色谱分离领域，具体为一种蛋白质分子印迹分离介质的制备及使用方法。
技术介绍
分子印迹技术(Molecular imprinting technology, MIT)是指制备对某一特定分子具有选择性识别能力的聚合物的技术。模板分子与功能单体相互作用形成超分子化合物，在交联剂的作用下形成聚合物，当在一定条件下除去模板分子后，即可得分子印迹聚合物(Molecular imprinting polymer, MIP)。 蛋白质印迹聚合物的制备方法通常分为包埋法、表面印迹法和抗原决定基法。表面印迹法由于其印迹位点在载体粒子表面或接近表面，具有较快的结合速率和解离速率，并减少包埋现象的发生，而且具有较高的热稳定性和机械强度，是一种理想的蛋白质印迹的方法。Shiomi等人通过共价键先将牛血清白蛋白(BSA)固定在硅球表面，再用有机硅烷化试剂进行聚合，得到BSA印迹硅球，吸附评价结果显示固定化模板的方法具有较好的印迹效果(Shiomi, T. ；Biomaterials. 2005, 26 (27) :5564-5571) 。传统的蛋白质印迹聚合物均是靠印迹位点对模板蛋白质进行选择性识别，而并未考虑到残留在聚合物中的蛋白质的立体识别效应，因此期望最大程度地将模板去除，以得到更多的印迹位点。本专利技术在表面印迹技术的基础上，制备的立体漂浮蛋白质分子印迹色谱固定相，只需洗去合适量的蛋白质，通过漂浮在基质表面的剩余蛋白质与印迹位点形成三维立体结构，共同对目标蛋白进行选择性识别。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，以达到对目标蛋白质的选择性分离与富集。本专利技术采用固定化蛋白表面印迹技术首先将目标蛋白固定在基质上，进一步采用部分包埋技术将与基质表面结合的蛋白质部位包埋。清洗掉部分包埋不很牢固的蛋白质，剩余的蛋白质将漂浮在基质表面。采用这种分离介质进行模板蛋白质的选择性分离，可以充分利用立体印迹效应，实现蛋白质的更好分离。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的—种立体漂浮蛋白质分子印迹色谱固定相的制备及使用方法，具体步骤为I.所选用的基质可以是大孔硅胶，无孔硅胶和高分子聚合物；可以为球形或整体材料的形态；基质表面修饰有氣基或环氧基。2.取I. Og修饰有氨基的基质与2 IOmL的10% 25% (v/v)戊二醛水溶液反应5 20h，将醛基修饰在基质表面；或取I. Og修饰有环氧基的基质与10 50mL的0. 5 5. OmoI/L的亚胺基二乙酸(IDA)溶液反应10 20h，将螯合配基IDA修饰在基质表面。3.取2 IOmL 5mg/mL的蛋白溶液与醒基修饰的基质在4°C下反应10 15h,由共价键将蛋白固定在基质表面；或先加入0.05 0. 20mol/L Cu(II)或Fe(II)金属离子溶液于IDA修饰的基质中，再通入蛋白溶液利用金属螯合作用将蛋白质固定。4.采用部分包埋技术将与基质表面结合的蛋白质部位包埋，包埋层可以是50mL含2% 10% (v/v)正硅酸乙酯(TEOS)和2% 10% (v/v)氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)或5mL含0. 1% 5.0% (v/v)丙基三甲氧基硅烷(PTMS)和0. I % 5.0% (v/v)氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)的PBS溶液(0. lmol/L, pH = 8. 0)水解而成的硅烷化层。5.加入50mL 10% 50% (v/v)草酸溶液反应5min 12h，定量去除由共价键固定的模板蛋白；或加入IOmL 10 IOOmM乙二胺四乙酸钠溶液(EDTA)和10% 50% (v/v)甲酸溶液，依次反应5min 12h定量去除由螯合作用固定的模板蛋白。6.得到的立体漂浮蛋白质分子印迹色谱固定相在特定 的缓冲液中对模板蛋白进行选择性识别，其剩余蛋白质链与印迹位点共同起到识别作用；上述缓冲液为0.01 0. lmol/L, pH = 6. 8 8. 0的磷酸盐缓冲液。7.本专利技术的色谱固定相可应用于固相萃取柱和液相色谱柱。与现有的技术相比，本专利技术的积极效果是(I)利用剩余蛋白质链的立体结构与印迹位点共同形成三维立体印迹识别的系统，克服了传统表面印迹法吸附容量低，选择性差的缺点。(2)去除模板蛋白的量可控，可通过控制模板去除量调节固定相的选择性。附图说明图I立体漂浮蛋白质分子印迹固定相不意图；图中I为基质，2为端基印迹点，3为包埋层，4为漂浮的蛋白质分子。图2立体漂浮蛋白质分子印迹固定相制备流程图。图3不同模板去除百分率的印迹硅球(MIP，A F)对血红蛋白的吸附情况及空白对照(NIP)。具体实施方式实施例I(I)娃胶表面的改性称Ig无孔娃胶(I. m)于IOOml圆底烧瓶,加入40mL超纯水，沸水煮2h，冷却，过滤，甲醇润洗后过夜干燥。向干燥的硅球中加入50mL甲苯(干燥)，缓慢滴加2mL 3-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷，120°C下回流17h，冷却抽滤，分别用丙酮、乙醇洗三次，烘干待用。(2)立体漂浮血红蛋白印迹娃球的制备称IOOmg上述材料于圆底烧瓶,加入25mL0. 75mol/L IDA溶液，70°C下水浴反应17h，大量水洗去剩余IDA。加入25mL 0. IOOmoI/LCuS04水溶液，振荡反应30min，洗去剩余CuS04。加入血红蛋白(Hb，5mg/mL)的PBS溶液(100mM,pH = 8. 0) 2mL,吸附IOmin,用PBS溶液洗去剩余的Hb,每次ImL洗3遍。加入ImL含丙基二甲氧基娃烧(PTMS)和氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)各IOuL的PBS(100mM，pH = 8. 0)溶液，室温下振荡，反应24h。依次用乙二胺四乙酸(EDTA)洗聚合物5min 180min，20%甲酸洗5min 12h，得到不同模板洗脱量的立体漂浮血红蛋白印迹硅球(标为A F)，用PBS溶液(lOOmM，pH = 8. 0)保存待用。经HPLC定量可得A F的模板洗脱百分率依次增大，分别为 3. 7% ,6. 4% ,8. 0%，22. 2% ,32. 0%和 43. 0%。空白对照物，非印迹聚合物(NIP)的制备除不加入模板蛋白质分子外，其余步骤同上。(3)吸附实验分别取IOmg上述A F聚合物及NIP，加入lmg/mL Hb的PBS溶液(100mM，pH = 8. 0)lmL。25°C下振荡吸附2h，吸附结果如附图3。A F的MIP吸附量均大于NIP，说明具有较好的印迹效果，其中模板洗脱率为22%的MIP(如图3，D)吸附量为最大。传统的蛋白质印迹聚合物仅通过印迹位点对蛋白质进行识别，而本专利技术所制备的 立体漂浮蛋白质分子印迹聚合物则通过印迹位点和剩余蛋白质链共同形成的立体空间对蛋白质进行识别。在模板洗脱率为3. 7%，6. 4%，8. 0%和22%时，随着模板洗脱率的增加，暴露的印迹位点逐渐增加，对目标蛋白质的吸附量也随之增加，在模板洗脱率为22%时达 到最大。而当模板洗脱率继续增加至32%和43%时，吸附量逐渐减小，这是因为起到立体识别作用的蛋白质分子逐渐减少，印迹聚合物的识别能力逐渐降低。因此在模板洗脱率为22%时，印迹位点-蛋白质链所构成的立体识别空间具有较高的识别能力。以上所述仅是本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种立体漂浮蛋白质分子印迹色谱固定相的制备及使用方法，其特征在于：将蛋白质分子首先通过物理或化学的方法与基质结合，将结合的端基包埋，进一步清洗掉结合不牢固的一部分蛋白质，剩余的蛋白质链漂浮在基质表面与在固定相表面留下的端基印迹位点一起构成立体的识别空间，实现印迹蛋白质的选择性分离。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孟子辉，雷雯，张维冰，薛敏，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：
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