高通量蛋白质多维阵列色谱分离系统技术方案

本发明专利技术是一种高通量蛋白质多维阵列色谱分离系统。现有技术仅限于单通道一维或两维色谱方法用于蛋白质组的色谱分析，存在分析周期长、操作复杂等不足。本发明专利技术在第一维色谱分离的基础上，将多通道色谱阵列用于色谱分离第二维的方法，使分析效率得到很大提高。多通道色谱阵列可扩展２－５０个色谱通道，通过多通道接口与第一维色谱连接，可高效完成逐柱富集、梯度洗脱的分离过程，为蛋白质组样品分析提供了有效手段。本发明专利技术方法所用各部件集成于一体，并与基质辅助激光电离质谱联用，可实现自动化的蛋白质组色－质仪。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是高通量蛋白质多维阵列色谱分离系统，及运用该系统的分离方法。
技术介绍
蛋白质组学是目前科学研究最热点领域之一。其研究实质是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的分离和分析。与静态的基因组不同，蛋白质有着复杂的翻译后修饰，在细胞内的表达是多样的、动态的。由于蛋白质组样品的高度复杂性，蛋白质组学的兴起和发展对现有的分析技术提出了新的需求和挑战。发展高通量、高分离能力的技术平台成为当前蛋白质组学研究的瓶颈。当前国际上蛋白质组研究的核心技术是双向凝胶电泳—质谱技术。尽管双向凝胶电泳是蛋白质组分离最常用的工具，但此技术本身在分析通量、灵敏度、分辨率以及自动化程度上还存在许多局限，难以满足大规模进行蛋白质组学研究的需要。研究可替代或补充双向凝胶电泳的新技术成为发展蛋白质组研究技术的主要目标。国内外在这方面开展了许多探索性工作，多种分离方法得到广泛应用和发展，如高效液相色谱，毛细管电泳及多维液相色谱等。由于蛋白质组样品的高度复杂性，二维乃至多维分离联用技术与质谱鉴定技术的结合被普遍认为是最具潜力的蛋白质组研究技术，在蛋白质组研究领域得到广泛的关注和重视。目前国内外在蛋白质的色谱高效分离方面只限于单通道一维和二维色谱系统的研究，多通道多维色谱分离系统(多于4个通道)尚无报道。尽管二维色谱系统在去年已有商品化的仪器推出，但其在分析通量上还存在极大的限制，一个样品需多次(多盐度梯度和反相梯度)的洗脱循环，使分析时间大大延长，一般分析一个经预分级处理简化的蛋白质组样品需2-3天。
技术实现思路
本专利技术的目的是获得一种高通量蛋白质多维阵列色谱分离系统。本专利技术的目的是获得用上述系统进行高通量蛋白质多维阵列色谱分离的方法。本专利技术的分析系统用如下方式实现 系统由并行阵列色谱柱(1)、单一色谱柱(4)和多通道点样装置构成，其特征是阵列色谱柱(1)通过多通道色谱连接口(5)与单一色谱柱(4)连接，阵列色谱柱尾均有柱开关(6)，色谱泵I(3)、单一色谱柱(4)、多通道色谱连接口(5)、色谱泵II(8)依次串连连接，以上构成系统的多维色谱阵列分离部分；微型三通混合室(10)、注射泵(9)、点样毛细管(2)、点样板(11)和三维自动移动平台(12)构成系统的多通道点样装置，微型三通混合室上(15)、下(17)两端口分别与阵列色谱柱柱出口和点样毛细管(2)连接，侧端口(16)与输送基质溶液的注射泵(9)连接，微型三通混合室(15)与阵列柱一一对应，点样毛细管(2)下是点样板(11)，点样板置于三维自动移动平台(12)上，上述各部件集成于一体。待测样品首先在单一色谱柱(4)上洗脱，洗脱流出物通过多通道色谱连接口(5)运用阵列柱开关(6)被逐柱依次富集至阵列色谱柱的各柱头(7)上，阵列色谱柱通过色谱泵II(8)进行色谱洗脱，与此同时通过多通道点样装置，色谱阵列各通道的洗脱流出物分别与基质溶液通过注射泵(9)在相应的微型三通混合室(10)内在线混合，洗脱物与基质混合物按设定间距被离散地点在点样板(11)上，样品供基质辅助激光解吸电离质谱检测。因此本专利技术分析系统由两维色谱构成，第一维色谱分离利用一根色谱柱，可采用离子交换(或体积排阻)色谱柱；第二维色谱分离利用多根色谱柱(多至50根)，可采用反相色谱柱。两分离系统通过多通道并行式多维色谱接口连接。第一维分离通过离子交换(或体积排阻)色谱快速实现(每个组分只需几分钟)，洗脱组分经多通道色谱接口或多位阀被切换顺次分别富集在第二维色谱阵列反相柱的柱头或富集柱上，此多个洗脱组分在第二维的分离通过并行色谱的方式一次洗脱完成。此两维阵列色谱系统的分析通量可表示为分析通量(2D-LC array)＝N1DfractionxT1D+1xT2D，而通常的单通道两维色谱系统的分析通量为分析通量(2D-LC)＝N1DfractionxT1D+ N1DfractionxT2D，(N为样品经第一维洗脱所分的组数，通常N＝2-50；T1D为第一维的洗脱时间，一般为几分钟；T2D为第二维的洗脱时间，一般为1-3小时)，由此可见，运用阵列色谱作为系统的第二维可极大地提高系统的样品分析通量。第二维多通道阵列色谱洗脱的流出组分通过微型点样系统被收集在MALDI板上进行TOF/TOF或Q/TOF质谱鉴定。与阵列色谱柱相应的微型三通混合室阵列，点样毛细管阵列，毛细管固定夹，输送基质毛细管阵列构成系统的微型点样部分。微型三通混合室阵列由与阵列色谱柱相应的微体积混合室构成，每个微体积混合室有三个端口上端口、下端口和侧端口。每个上端口分别和第二维色谱柱连接，下端口分别和点样毛细管连接，侧端口和基质输送泵连接。毛细管固定夹内刻有等间距的槽道，用来固定点样毛细管阵列。本专利技术中，阵列色谱柱柱头连有富集柱(14)，柱开关(6)连接在富集柱尾。本专利技术中，并行阵列色谱柱是2-50根色谱柱。本专利技术中，阵列色谱柱(1)通过多位阀(13)与单一色谱柱(4)连接。本专利技术中，单一色谱柱洗脱液富集后并行阵列色谱柱是同时进行色谱洗脱。本专利技术中，切换至阵列色谱柱的洗脱流出物富集在各富集柱上(14)。本专利技术中，系统与基质辅助激光解吸电离质谱联用。本专利技术获得了如下良好效果多个通道同时进行第二维色谱分离，实现了超高分析通量，运用多通道并行式多维色谱接口，使系统获得了多维切换技术，并使多个色谱柱能同时分离，将多维分离流份通过点样机转移至MALDI板上进行TOF/TOF或Q/TOF质谱鉴定，可实现蛋白质高通量、快速、高效分析。本专利技术用色谱-色谱为主的分离平台，充分发挥色谱分离能力强、分离模式多，易于与质谱鉴定方式联用、易于自动化等优势，构建基于多维高效色谱分离的阵列蛋白质组多维分离技术平台，使蛋白质组技术平台在分离效率和分析通量上有大幅度的提高。目前用2D-gel分析一个样品至少需几天时间，单通道2D-LC需几十个小时。由于二维LC分离平台的分辨率和分析通量主要由第二维的分离决定，在第二维采用多个通道同时进行分析，可极大地提高整个系统的分析通量。另外用两列色谱柱交替进行洗脱，会有更充足的时间进行第二维梯度分离，从而进一步提高2D-LC的分辨率。用多个通道构建的阵列多维平台，其分析通量同刚商品化的单通道2D-LC比，将会有十几倍乃至几十倍的提高，突破蛋白质/肽的分析在分辨率，灵敏度，特别是分析通量等方面的局限性，为蛋白质组的研究提供更加有效的技术手段，从而进一步促进此领域的研究进程。附图说明图1是本专利技术分析系统结构示意图。图2是本专利技术系统运用多位阀13、富集柱14的系统结构示意图。图3是本专利技术多通道色谱阵列接口图。图4是本专利技术微型三通混合室结构图。上述图中1是阵列色谱柱，2是点样毛细管，3是色谱泵I，4是单一色谱柱，5是多通道接口，6是柱开关，7是阵列色谱柱的柱头，8是色谱泵II，9是注射泵，10是微型三通混合室，11是点样板，12是三维自动移动平台，13是多位阀，14是富集柱，15、17分别是微型三通混合室上、下两端口，16是水平端口。具体实施例方式一.高通量蛋白质多维阵列色谱分离系统的建立1.多通道色谱接口的制作取一长5cm内径为500μm的聚醚醚酮(PEEK)毛细管，在PEEK毛细管的一侧用380μm的钻头钻出直径为380μm的小孔30个，孔与孔的间距为1mm，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高通量蛋白质多维阵列色谱分离系统，系统由并行阵列色谱柱（１）、单一色谱柱（４）和多通道点样装置构成，其特征是阵列色谱柱（１）通过多通道色谱连接口（５）与单一色谱柱（４）连接，阵列色谱柱尾均有柱开关（６），色谱泵Ⅰ（３）、单一色谱柱（４）、多通道色谱连接口（５）、色谱泵Ⅱ（８）依次串连连接，以上构成系统的多维色谱阵列分离部分；微型三通混合室（１０）、注射泵（９）、点样毛细管（２）、点样板（１１）和三维自动移动平台（１２）构成系统的多通道点样装置，微型三通混合室上（１５）、下（１７）两端口分别与阵列色谱柱柱出口和点样毛细管（２）连接，侧端口（１６）与输送基质溶液的注射泵（９）连接，微型三通混合室（１５）与阵列柱一一对应，点样毛细管（２）下是点样板（１１），点样板置于三维自动移动平台（１２）上，上述各部件集成于一体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张祥民，刘春丽，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]