定量蛋白质系亲和色谱树脂的蛋白质泄露的方法技术

本发明专利技术提供定量蛋白质系亲和色谱介质（例如蛋白质Ａ、蛋白质Ｇ和蛋白质Ｌ系亲和色谱介质）的蛋白质泄露的方法，其中此类蛋白质用于分离和／或除去结合所述蛋白质的分子（例如免疫球蛋白）。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及，所述树脂包括但不限于蛋白质A、蛋白质G和蛋白质L系亲和色谱树脂。
技术介绍
蛋白质系亲和色谱已广泛用于从实验室规模、试生产规模到生产规模的各种规模的蛋白质、DNA以及其他化学和生物分子的纯化。参见，例如，Hermanson等人，Immobilized Affinity Ligand Techniques,Academic Press,Inc. San Diego, CA,pgs. 317-346(1992)。 其中，蛋白质A(PrA)、蛋白质G(ft~G)和蛋白质L(ft~L)系亲和色谱是公知的并广泛使用的用于免疫球蛋白(Ig)的检测和/或纯化的方法，然而，它们就结合Ig而言各自具有不同的特异性。举例而言，PrA系试剂在生物
中具有特别广泛的应用，例如在亲和色谱中用于捕获和纯化抗体以及用于抗体检测法中。目前，PrA系的亲和介质或树脂可能是用于从包括细胞培养物在内的不同样品分离单克隆抗体及其片段的最广泛使用的亲和介质。因此，各种包含蛋白质A-配体的基质是可商购的，包括，例如，ProS^ _vA High Capacity、 ProSep vA Ultra和 ProSep(g) UltraPlus (Millipore) 1 Protein A Sepharose >rmp Protein A Sepharose Fast Flow、MabSelect 、MabSelect Xtra 和 MabSelect SuRe (GE Healthcare)、Poros MabCapture A (Applied Biosystems)以及 Sartobind Protein A (Sartorius)。专利技术概述 尽管蛋白质系亲和色谱树脂例如蛋白质A、G和L系亲和色谱树脂对于纯化与它们结合的分析物或分子，例如免疫球蛋白(Ig)(在PrA、PrG和的情况下)，是非常合乎需要的，但是一个缺点是蛋白质例如蛋白质A、G或L与感兴趣的分析物或分子例如免疫球蛋白一起从色谱柱泄露。例如，由于例如能够以高容量特异地结合抗体并能够达到高纯度，所以蛋白质A系亲和色谱对于大规模抗体纯化是非常合乎需要的，然而，由于洗出的PrA自身的生物学活性和毒理学性质，其通常被认为是免疫球蛋白洗出液中不期望的杂质。因此，在本专利技术的一些方面，监测PrA泄露并最终在后续的色谱步骤中将其除去是有益的。例如，一种最小化PrA泄露的方法是使用显示出从色谱柱的最小量PrA泄露的PrA树脂。因此，在一些方面，本专利技术的方法可用于鉴定显示出从色谱柱的最小量PrA泄露的蛋白质系亲和色谱树脂，包括但不限于PrA、PrG和PrL系亲和色谱树脂。此类蛋白质系亲和色谱树脂包括已知的树脂和可能在将来被开发的那些树脂。还开发了许多基于酶联免疫吸附测定法(ELISA)的筛选测定法用于检测色谱柱的PrA泄露。然而，大多数这些测定法在本质上是定性的并且通常显示出较高的变异性(例如，彡25% )，因而不适合用作分析工具用于例如提供PrA系亲和色谱树脂的比较、鉴定显示出最小量PrA泄露的树脂以及用于在亲和色谱和后续色谱步骤之后监测抗体洗出液池中的洗出的PrA。由于与荧光标记物相关的高灵敏度和选择性，所以此类标记物被广泛用于生物化学和化学研究中。例如，之前已使用荧光染料检测来自亲和树脂的洗出的蛋白质A， 然而，这些染料大多用于生成定性信息例如检测，并且不能提供任何定量信息，例如洗出的 PrA 的量。参见，例如，Carter-Franklin 等人，Journal of Chromatography A, 1163 105-111(2007)。本专利技术至少部分涉及用例如荧光标记物检测色谱介质或树脂的蛋白质(例如 PrA)泄露的定量方法。本专利技术方法显示出低于10%的变异性并特别适于鉴定显示出最小量PrA泄露的PrA色谱树脂。本专利技术一方面提供定量PrA系亲和色谱树脂的PrA泄露的方法，其中所述方法包括以下步骤(a)用一种或多种荧光标记物标记所述PrA系色谱树脂；(b)将标记的树脂分成相等的第一部分和第二部分；(c)用适合的方法处理第一部分以从所述树脂释放标记的 PrA，并且向所述第二部分加入过量的Ig;(d)测量来自步骤(c)所述第一部分中经处理的树脂的荧光和PrA浓度()；以及(e)测量来自步骤(c)所述第二部分的树脂Ig洗脱浓度()和Ig洗出液中的荧光信号(FLIg)，其中通过计算{(FLIg)/((FL消化物)/)}/定量 PrA 泄露。本专利技术的另一方面提供定量PrA系亲和色谱树脂的PrA泄露的方法，其中所述方法包括以下步骤(a)用一种或多种荧光标记物标记所述PrA系色谱树脂；(b)向标记的树脂加入过量的Ig并且测量来自所述树脂的树脂Ig洗脱浓度()和Ig洗出液中的荧光信号(FLlg) ； (c)从所述树脂除去残留的Ig，然后用适合的方法处理所述树脂以从所述树脂释放标记的PrA;以及(d)测量来自经处理的树脂的荧光和PrA浓度()，其中通过计算KFLIg)/((FL消化物)/)}/定量PrA泄露。在一些实施方案中，本专利技术的方法用于定量PrG系亲和色谱树脂的蛋白质G(ft~G) 的泄露。因此，本专利技术的又一方面提供定量PrG系亲和色谱树脂的PrG泄露的方法，所述方法包括以下步骤(a)用一种或多种荧光标记物标记所述PrG色谱树脂；(b)将标记的树脂分成相等的第一部分和第二部分；(c)用适合的方法处理第一部分以从所述树脂释放标记的ft~G，并且向所述第二部分加入过量的Ig; (d)测量来自步骤(c)所述第一部分中经处理的树脂的荧光(FL·。和PrG浓度()；以及(e)测量来自步骤(c)所述第二部分的树脂Ig洗脱浓度()和Ig洗出液中的荧光信号(FLlg)，其中通过计算{(FLIg)/((FL· /)}/定量 PrG 泄露。在又一方面，定量PrG系色谱树脂的PrG泄露的方法包括以下步骤(a)用一种或多种荧光标记物标记所述PrG系色谱树脂；(b)向标记的树脂加入过量的Ig并且测量来自所述树脂的树脂Ig洗脱浓度()和Ig洗出液中的荧光信号(FLlg) ； (c)从所述树脂除去残留的Ig，然后用适合的方法处理所述树脂以从所述树脂释放标记的I^rG ；以及(d)测量来自经处理的树脂的荧光(FLm物)和PrG浓度(PrG])，其中通过计算{(FLIg)/((FL消化/)}/定量 PrG 泄露。在进一步的实施方案中，本专利技术的方法用于定量PrL系亲和色谱树脂的蛋白质 L(PrL)的泄露。因此，在本专利技术的另一方面提供定量PrL系亲和色谱树脂的PrL泄露的方法，所述方法包括以下步骤(a)用一种或多种荧光标记物标记所述PrL系色谱树脂；(b)将标记的树脂分成相等的第一部分和第二部分；(c)用适合的方法处理第一部分以从所述树脂释放标记的ft~L，并且向所述第二部分加入过量的Ig; (d)测量来自步骤(c)所述第一部分中经处理的树脂的荧光(FL·物)和PrL浓度()；以及(e)测量来自步骤(c)所述第二部分的树脂Ig洗脱浓度()和Ig洗出液中的荧光信号(FLIg)，其中通过计算KFLlg)/ ((FL消化物)/ )} / 定量 PrL 泄露。在另一方面，定量PrL系本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．定量ＰｒＡ系亲和色谱树脂的ＰｒＡ泄露的方法，所述方法包括以下步骤：（ａ）用一种或多种荧光标记物标记所述ＰｒＡ系色谱树脂；（ｂ）将标记的树脂分成相等的第一部分和第二部分；（ｃ）用适合的方法处理第一部分以从所述树脂释放标记的ＰｒＡ，并向所述第二部分加入过量的免疫球蛋白（Ｉｇ）；（ｄ）测量来自步骤（ｃ）所述第一部分中经处理的树脂的荧光（ＦＬ消化物）和ＰｒＡ浓度（［ＰｒＡ］）；以及（ｅ）测量来自步骤（ｃ）所述第二部分的树脂Ｉｇ洗出液浓度（［Ｉｇ］）和Ｉｇ洗出液中的荧光信号（ＦＬＩｇ），其中通过计算｛（ＦＬＩｇ）／（（ＦＬ消化物）／［ＰｒＡ］））｝／［Ｉｇ］定量ＰｒＡ泄露。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：卞南英，
申请(专利权)人：米利波尔公司，
类型：发明
国别省市：US