肽的高效生产制造技术

本发明专利技术涉及生产肽的方法和由此生产的肽。与现有技术方法生产肽相比，根据本发明专利技术生产肽可以更高效。本发明专利技术的生产方法具有产率、纯度和/或价格上的优势。还公开了营销肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及肽的生产方法及由此生产的肽。与现有技术方法生产肽相比，根据本专利技术生产肽可以更高效。本专利技术的生产方法具有产率、纯度和/或价格上的优势。还公开了营销肽的方法。
技术介绍
肽在基础研究及临床实践中变得越来越有用。对肽的兴趣可归因于它们在许多生物途径中作为介质的作用以及它们独特的固有性质。例如，许多肽对于其靶标具有高度特异性，而与非靶标分子的非特异性结合低，因而药物-药物相互作用最小化，而且许多肽显示随时间推移在组织中的积累很少，因而减少了副作用。而且，肽通常在体内分解为构成它们的氨基酸，从而减少了有毒代谢中间产物带来的并发症的危险。肽的市场价值在生命科学领域通常可归为五大类细胞因子、酶、激素、单克隆抗体和疫苗。根据2008年的Frost&SulIivan市场调查报告,这些大类在美国可进一步细分为疫苗(34% )、单克隆抗体(30% )、重组激素和蛋白质(10% )、基因治疗(6% )、细胞治疗(4%)、反义(3%)、干扰素(3%)、白介素(2%)、生长因子(1%)以及其它(7%)。这些类别的每一项都保持高速增长。例如，从2004年至2007年，仅单克隆抗体市场一项其收益就几乎翻倍，从63亿美元增加至126亿美元。另外，几项新产品，包括Bydureon (艾塞那肽LAR,用于治疗糖尿病；Amylin/Eli Lilly)、Extavia (干扰素运-lb,用于治疗多发性硬化症；Novartis)以及Simponi (戈利木单抗,用于治疗类风湿和银屑病关节炎；Centocor),最近已被FDA批准。此外，肽市场很有可能会继续增长。例如，在2008年开发的633种药物中，几乎一半是肽。分析师估计未来五年的混合年增长率为百分之八，使得2013年的收益可能达到200亿美元，这几乎占了预测的生物医药市场总收益的百分之十五。肽作为基础研究及诊断平台的试剂也存在更多的机会。虽然肽科学领域的进步已经导致了令人瞩目的商业增长，但仍有几项障碍需要克月艮。例如，与传统小分子治疗剂相比，肽常常具有递送和稳定性的问题。为解决这些问题，尝试了包括经口、经鼻及肺部的递送。然而，这些尝试通常需要更高的肽剂量或者会产生不希望的药物代谢动力学特征。增加肽应用的一个最大的障碍是肽本身的成本，它通常比生产小分子治疗剂的成本高的多。例如，Nutropin AQ 是由Genentech生产的一种形式的重组人生长激素，用来给予青春期生长缺陷的患者，其花费为每年30，000美元。当肽用于研究目的时，高价格成为获得肽的更大障碍。例如，￠-淀粉样蛋白(1-42)肽是一种研究用肽，它与阿尔茨海默病的发病强烈相关。一项对各个肽生产商的价格调查表明，研究级别的￠-淀粉样蛋白(1~42)的价格区间从 $225/mg(21st Century Biochemicals)至 $1, 490/mg(Sigma-Aldrich)，其中普遍价格为 $300-$320/mg(AnaSpec, California Peptide,Innovagen, rPeptide) (2009年估计价格取自商品目录)。由于肽的重要性及其高价格，一直以来都存在期盼已久但尚未满足的降低肽成本的需要。肽的工业及医药应用产生了对改进生产及纯化手段的需要，这些改进可以是效率、价格和/或产品质量的改进。因此，本专利技术涉及肽的生产方法，以及生产的肽。也公开了营销肽的方法。
技术实现思路
在多个实施方案中，本专利技术涉及生产目标肽的方法。根据本专利技术的方法，生产包含亲和标记物、可裂解标记物和目标肽的融合肽，其后，该融合肽与亲和材料结合，裂解该融合肽以释放出目标肽；从亲和材料上移除目标肽。通常，在融合肽与亲和材料结合后，洗涤亲和材料以去除未结合的物质。此外，在从亲和材料上移除目标肽之后，目标肽可进一步修饰或包装以供分发。对目标肽没有限制，可包括多种肽。例如，在多个实施方案中，所述目标肽选自由淀粉样蛋白P、降钙素、恩夫韦肽、依泊汀、依泊汀S、红细胞生成素、艾塞那肽、因子VIII、因子X、葡糖脑苷脂酶、胰高血糖素样肽-I (GLP-I)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人生长激素(hGH)、胰岛素、胰岛素A、胰岛素B、胰岛素样生长因子I (IGF-I)、干扰素、利拉鲁肽、促生长素抑制素、特立帕肽和组织纤溶酶原激活物(TPA)组成的组。在多个实施方案中，目标肽选自淀粉样蛋白P、恩夫韦肽、艾塞纳肽、胰岛素和特立帕肽。融合肽可通过多种方法生产。在一个实施方案中，该融合肽在细菌表达系统例如大肠杆菌表达系统中产生。在替代实施方案中，表达系统是酵母表达系统或哺乳动物表达系统。在多个实施方案中，根据本专利技术的融合肽进一步含有包涵体指引肽。在这样的实施方案中，在融合肽与亲和材料结合之前，可通过将包涵体与表达系统中细胞的其余部分分离而从表达系统中分离该融合肽。在最初的分离之后，可溶解融合肽以便进一步处理。在多个实施方案中，该包涵体指引肽选自为类固醇异构酶(ketosteroid isomerase)的包涵体指引肽、类固醇异构酶的包涵体指引功能片段、类固醇异构酶的包涵体指引功能同系物、BRCA2肽、BRCA2的包涵体指引功能片段、或BRCA2的包涵体指引功能同系物。在多个实施方案中，亲和标记物选自由聚组氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸和聚谷氨酸组成的组。此外，可裂解标记物可选自由Trp、His-Met, Pro-Met以及非天然氨基酸组成的组。在融合肽含有一个以上的可裂解标记物时，各个可裂解标记物可以是正交的(orthogonal)，也就是说，它们对于任一特定的裂解剂有着不同的反应性。在多个实施方案中，裂解步骤由选自由NBS、NCS和Pd(H2O)4组成的组的试剂执行。根据本专利技术的方法还涉及评估目标肽的商业市场，包括a)根据本文描述的方法生产目标肽山)使样品量的目标肽可无成本或以最低成本获得；以及c)测量在一段时间内对目标肽的需求数量。除以上方法之外，本专利技术还涉及根据本专利技术生产的目标肽，尤其是纯度大于99%的目标肽。另外，还涉及在根据本专利技术生产目标肽的表达系统中使用的载体。例如，根据本专利技术的载体可以包含编码亲和标记物的核苷酸序列；编码可裂解标记物的核苷酸序列；以及编码目标肽的核苷酸序列；其中这些核苷酸以可操作的组合排列，进一步地其中该可操作组合表达产生含有亲和标记物、可裂解标记物和目标肽的融合蛋白。本专利技术另外的实施方案涉及包含本文所述载体的细胞以及根据本文所述方法生产的融合蛋白。附图说明本专利技术的各种特征在所附权利要求书中详细阐述。通过参考以下阐述，利用本专利技术原理的说明性实施方案的详述和附图，将获得对本专利技术的特征及优势的更好的理解，在附图中图I显示修饰形式的商业可得的pET_19b载体(pET_19bmhbl)。这样的载体可用来生产在两侧有两个NcoI限制酶切位点的KSI序列和在两侧有两个XhoI限制酶切位点的组氨酸标记物-色氨酸-P -淀粉样蛋白(1-42)序列。 图2显示通过添加L-阿拉伯糖激活商业可得的pBAD启动子的转录。阿拉伯糖与AraC(图中为“C”)结合，并使蛋白质释放O2位点并与紧邻I1位点的I2位点结合。这释放出DNA环并使得转录开始。第二水平的控制存在于cAMP激活蛋白(CAP)-cAMP复合物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔·H·B·斯托威尔，乔纳森·卡拉瑟斯，特拉维斯·涅姆科夫，布莱恩·海斯特尔，莱斯利·布克斯，米哈伊尔·普拉姆，
申请(专利权)人：科罗拉多州立大学董事会法人团体，阿米德生物有限公司，
类型：发明
国别省市：