用于过继细胞疗法的细胞培养的改进方法技术

本发明专利技术涉及一种培养用于细胞疗法用途的细胞的改进方法，该方法包括：在抗原呈递细胞和/或饲养细胞的存在下使目标细胞生长，如果生长表面不是由透气性材料构成则培养基体积与表面积的比高达1ml/cm2，如果生长表面是由透气性材料构成则培养基体积与表面积的比高达2ml/cm2。在生长周期开始时目标细胞的表面密度小于0.5×106细胞/cm2，目标细胞的表面密度加上抗原呈递细胞和/或饲养细胞的表面密度至少约为1.25×105细胞/cm2。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体上涉及培养细胞的方法，更具体地涉及用于细胞疗法的细胞的培养。
技术介绍
细胞培养是导致细胞疗法的成本和复杂性的主要因素。就目前的方法而言，培养细胞的工艺既耗时成本又高。通常，为了制备出大量的细胞而采用在各阶段中进行的体外培养工艺。在最初的阶段，目标细胞是被置于细胞培养装置内的细胞组合物中的相对较小的群体。在此阶段，细胞组合物通常包括目标细胞的来源(例如外周血单核细胞)、刺激目标细胞的生长和/或提呈抗原的饲养细胞。让其中驻留细胞的培养基通常处于不受干扰状 态的培养装置及方法是有利的，因为这些细胞保持为相对未受干扰的状态。这种装置包括标准组织培养板、培养瓶、和培养袋。在各阶段中进行的培养通常是由以下步骤组成让细胞组合物消耗培养基中的生长基质(如葡萄糖)、去除用过的培养基、用新鲜培养基更换用过的培养基、以及重复该步骤直到获得期望数量的目标细胞。常常是，当目标细胞群增加且需要额外的生长表面时，将细胞组合物转移到其它装置中以开始制备的新阶段。然而，就常规方法而言，当生长表面上的细胞群增加时，目标细胞的群生长速率减慢。最终结果是制备相当数量的目标细胞群既很耗时又复杂。用于产生具有针对Epstein Barr病毒的抗原特异性的T淋巴细胞(EBV-CTL)的制备方法的现有技术状态提供了制备复杂性的一个例子。在使EBV-CTL实现最佳扩增的常规方法中使用标准24孔组织培养板，各孔具有2cm2的供细胞驻留的表面积，由于气体传输要求而将培养基体积限制在lml/cm2。通过在经辐照抗原呈递细胞系(可以是淋巴母细胞系(LCL))存在下放置入由PBMC(外周血单核细胞)组成的细胞组合物，以开始培养工艺，约I X 106PBMC/cm2与2. 5 X IO4经辐照抗原呈递细胞/cm2表面密度(即细胞/cm2生长表面)比为约40 I。这促使细胞组合物中的EBV-CTL群在数量上扩增。9天后，在经辐照抗原提呈LCL存在下、以4 I的新表面密度比、在大约2. 5X IO5EBV-CTIVcm2的最小表面密度下，EBV-CTL再次选择性地扩增。将培养基体积限制在生长表面积的最大比为lml/cm2以使氧气能够到达细胞，这对生长溶质(例如葡萄糖)产生了限制。结果，可以达到的最大表面密度约为2X 106EBV-CTL/cm2。因此，最大每周细胞扩增率约为8倍(即2 X IO6EBV-CTL/cm2除以2. 5X105EBV-CTL/cm2)以下。EBV-CTL的继续扩增要求每周将EBV-CTL转移到另外的24孔板中且进行抗原再刺激，并且每周更换两次24孔板中各孔内的培养基和生长因子。因为在常规方法中当EBV-CTL表面密度达到各孔的可能最大量时导致EBV-CTL群的扩增速率减慢，所以必须在较长的制备期(经常长达4-8周)内重复这些操作，以获得充分数量的EBV-CTL以用于细胞输注和质控检测(例如无菌、鉴别和效能测定)。EBV-CTL的培养只是细胞疗法所特有的复杂细胞制备工艺的一个例子。因此，需要一种可以缩短制备时间同时降低制备成本和复杂性的、培养用于细胞疗法的细胞的更实用方法。我们已创建了提高整个制备中的细胞群生长速率的新方法，由此减小制备细胞的复杂性和所需时间。
技术实现思路
已发现，与目前可能方法相比，通过采用允许在整个制备工艺中定期地再建立非常规条件的分阶段制备工艺，可以在更短的时间段内以更经济的方式进行用于细胞疗法的细胞制备。所述非常规条件包括减小的目标细胞的表面密度(即细胞/cm2)、目标细胞与抗原提呈细胞和/或饲养细胞的新比率、和/或使用具有增加的培养基体积/表面积比且由透气性材料构成的生长表面。本专利技术的具体实施方式涉及用于细胞疗法用途的细胞的改进培养方法。这些方法包括如下方法通过采用使目标细胞群能够相对于常规方法在整个制备工艺中维持更高生长速率的各种新方法，来降低制备期望数量的目标细胞的所需时间、成本和复杂性。本专利技术的一个方面是在多阶段中执行培养工艺并且在一个或多个阶段的开始时 建立使目标细胞群的生长速率能够超过目前可能达到的生长速率的各种条件。在培养的至少一个阶段，优选在几乎所有的阶段，建立初始条件，所述初始条件包括目标细胞，以非常规地低的表面密度且以非常规的抗原呈递细胞(和/或饲养细胞)/目标细胞的比，驻留在非透气性或透气性生长表面。通过应用本专利技术此方面的新型实施方式，目标细胞群可以超越常规方法所允许在更短时间内经历更多的倍增，由此缩短制备期。本专利技术的另一方面是以多阶段实施培养工艺并且在一个或多个阶段开始时建立各条件，使得目标细胞群的生长速率超过目前可能达到的生长速率。在培养的至少一个阶段，优选在几乎所有的阶段，建立条件，所述条件包括目标细胞，以非常规地高的培养基体积/生长表面积之比，驻留在透气性材料构成的生长表面上。通过采用本专利技术这个方面的新型实施方式，目标细胞群可以超过常规方法所允许在更短时段内经历更多的倍增，由此缩短制备期。本专利技术的另一个方面是在多阶段中执行培养工艺并且建立各阶段的条件，使得目标细胞群的生长速率超过目前可能达到的生长速率。在培养的至少一个阶段，优选在几乎所有阶段，建立初始条件，所述初始条件包括目标细胞，以非常规地低的表面密度(即细胞/Cm2)、以非常规的抗原呈递细胞(和/或饲养细胞)/目标细胞的比、且在非常规的抗原呈递细胞(和/或饲养细胞)/目标细胞之比的情况下，驻留在透气性材料构成的生长表面。通过采用本专利技术这个方面的新型实施方式，目标细胞群可以超过常规方法所允许在更短时段内经历更多的倍增，由此缩短制备期。附图说明基于以下对本专利技术各种实施方式的详细说明并结合附图将更全面地理解本专利技术，其中图IA示出了实施例I中在最初I天内的初始刺激后抗原特异性T细胞群经历至少7次细胞倍增。图IB示出了实施例I的利用四聚体分析所确定的随时间推移细胞组合物内的T细胞群扩增幅度的数据。图IC示出了实施例I中在23天期间内抗原特异性T细胞的群生长速率。图2的表格示出了在实施例I中的抗原特异性T细胞的可能扩增与观察到的倍增之间差异。图3A示出了实施例2中在刺激后抗原特异性T细胞的存在。图3B示出了实施例2中当表面密度从I X IOfVcm2减小到3. I X 10Vcm2同时维持4I的抗原特异性T细胞与抗原呈递细胞的比时抗原特异性T细胞群的扩增。图3C示出了实施例2中当表面密度从I X IOf Vcm2减小到3. I X 10Vcm2同时在固定数量抗原呈递细胞存在下抗原特异性T细胞群的扩增。图4示出了当继续图3中所示的工作时所获得结果的一个例子，该例子进一步证明当目标细胞需要其它细胞的支持时，只要给目标细胞提供充分的饲养细胞和/或抗原呈递细胞，那么非常规地低的目标细胞表面密度也能够启动群扩增。图5示出了显示通过在三种不同细胞表面密度(CTL/cm2)下开始培养而重复目标细胞的群扩增幅度的能力的直方图。图6示出了用于生成数据的透气性测试装置的剖视图。图7A示出了与实施例5中所执行的常规方法相比较的根据本专利技术制备抗原特异性T细胞的生长曲线。图7B示出了对于实施例5，在根据本专利技术制备的抗原特异性T细胞中细胞存活率显著高于常规方法，其利用流式细胞术的前向散射与侧向散射分析所测定。图7C示出了对于实施例5，根据本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡安·F·维拉，克莱奥·M·鲁尼，安·M·里恩，约翰·R·威尔森，
申请(专利权)人：威尔森沃尔夫制造公司，
类型：发明
国别省市：