【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，涉及了柿子脱涩相关基因的克隆表达，以及柿叶片基因瞬时表达的体系建立。
技术介绍
柿原产中国，其味道鲜美，对人类健康良好，是东亚地区(中国，日本，韩国等)最受欢迎的水果之一，柿子的独特之处在于其果实在发育期间能累积单宁(PAs)，单宁是高分子物质，其中可溶性单宁是柿果实涩味的主要呈现物质。 柿子根据其脱涩类型以及种子是否影响果实的涩味及颜色可以分为四类完全甜柿(PCNA);完全涩柿(PCA);非完全甜柿(PVNA);非完全涩柿(PVA)。甜柿果实发育早期丧失合成单宁的能力，故其在树上能自然脱涩，成熟采收时果实不呈涩味，可直接食用；涩柿果实采后需经脱涩处理后方可食用。柿果的脱涩研究已经取得了很大的成功，例如树上乙醇蒸气包裹果实，高浓度的二氧化碳或氮气处理，温水浸泡或者交替冻融等都能完成脱涩。而且研究表明高浓度的二氧化氮处理能够使柿果在脱涩的同时保脆。关于柿果脱涩的机制很早以前就有人开始研究了。已有研究报道，脱涩处理过程中伴随着大量的乙醛累积。Matsuo和Ito (1977)提出二氧化碳脱涩处理中涉及了两个相对独立的过程。首先，果...
【技术保护点】
一种柿子脱涩相关基因的克隆与瞬时表达方法，通过以下步骤实现：？（1）柿果实中ADH和PDC基因家族成员3’端序列的获得：首先进行柿子组织RNA的提取，3“CDNA和5“CDNA逆转录得到CDNA模板，通过查找NCBI数据库上其他植物上已知的ADH和PDC基因家族成员序列，然后用ClustalX？？v？1.81软件比对找到保守区间并在其间设计兼并引物SEQ？ID？N0：1和SEQ？ID？N0：2，克隆2个ADH基因部分编码片段SEQ？ID？N0：39和SEQ？ID？N0：40；根据前面兼并克隆到的ADH编码区片段以及NCBI上已公布的ADH？和PDC基因家族EST序列，设计引...
【技术特征摘要】
1.一种柿子脱涩相关基因的克隆与瞬时表达方法，通过以下步骤实现 (1)柿果实中ADH和PDC基因家族成员3’端序列的获得首先进行柿子组织RNA的提取，3’⑶NA和5’⑶NA逆转录得到⑶NA模板，通过查找NCBI数据库上其他植物上已知的ADH和PDC基因家族成员序列，然后用ClustalX v I. 81软件比对找到保守区间并在其间设计兼并引物SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，克隆2个ADH基因部分编码片段SEQ ID NO:39和SEQ ID NO 40 ;根据前面兼并克隆到的ADH编码区片段以及NCBI上已公布的ADH和PDC基因家族EST序列，设计引物SEQ ID NO :3 16，利用3，RACE克隆技术体系，PCR扩增，片段回收，连接，转化，涂板，送测，最终分别获得了 3个ADH和4个PDC基因家族成员的3’端序列 SEQ ID NO :41 47 ； (2)柿果实中ADH和PDC基因家族成员在柿果实脱涩处理中的基因表达分析首先完成柿子二氧化碳和乙烯脱涩处理，果肉RNA提取和cDNA合成，用步骤(2)中得到的3’端序列的UTR区设计特异引物SEQ ID NO : 17 30，引物特异性检测，熔点曲线分析、凝胶电泳分析和定量PCR产物再测序确认序列的正确性，实时定量PCR分析ADH和PDC基因家族各成 员在处理与对照中的表达模式； (3)柿果实中ADH和PDC基因家族成员全长序列的获得以及柿叶片瞬时表达体系构建根据获得的3’端序列设计5’ RACE引物SEQ ...
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