本发明专利技术公开了一种检测血浆中亚甲蓝含量的方法，包括如下步骤：(a)向空白血浆中加入羧甲基-β-环糊精饱和溶液，使其浓度为1～4.5mmol/L，定容，得血浆空白样本；(b)向空白血浆中加入定量的亚甲蓝溶液，并加入羧甲基-β-环糊精饱和溶液，得含亚甲蓝浓度为Cs的血浆标准样本；(c)向含亚甲蓝的待测血浆样本中加入羧甲基-β-环糊精饱和溶液，得含亚甲蓝浓度为Cx的血浆待测样本，检测上述样本的荧光峰强度或荧光峰面积；然后按对照品比较法计算即可得到待测血浆样本中的亚甲蓝浓度Cx。本发明专利技术的最低检测限已经低至0.012μmol/L，取得了意想不到的效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于临床检验、药物分析、生物分析和分析化学领域。
技术介绍
为了降低临床上输血感染病毒的危险，增强输血的安全性，一般采用亚甲蓝灭活血浆中的病毒，即光化学病毒灭活法，即通过在血浆中加入一定量的光敏剂亚甲蓝，在光照下产生光化学反应，从而使血浆中病毒失活。为了保证血浆的安全性，在灭活前必须保证血浆中有足够浓度的光敏剂亚甲蓝(即足够高的释放量)，在灭活后的成品血浆中又必然保证 有足够低浓度的光敏剂亚甲蓝(即足够低的残留量)，从上述血浆处置工艺分析，这显然是互相矛盾的。为了较好地解决这对矛盾，通常使用成套病毒灭活袋，它由亚甲蓝贮藏装置、光照病毒灭活袋、亚甲蓝过滤装置、成品血浆贮藏袋及其相应的管线和开关组成。在血浆注入并通过亚甲蓝贮藏装置时，其中的亚甲蓝被释放出来，随血浆进入光照病毒灭活袋，在病毒灭活之后，通过亚甲蓝过滤装置滤除大多数的亚甲蓝，从而获得临床用成品血浆。经过过滤装置滤除的血浆，其残留的亚甲蓝的浓度虽然在安全范围内，但对于必须大量或长期输注血浆或输血浆后预期将长期存活的患者，其影响仍不得而知，特别是致突变的风险有可能增加，所以控制血浆中残留亚甲蓝浓度有重要意义。目前，检测血浆中亚甲蓝含量的测定方法有分光光度法、化学发光法、高效液相色谱法及以金纳米微粒为探针的共振瑞利散射法等，这些方法有灵敏度低和/或操作繁琐等缺点，常常还需要消耗较大量的血浆。2012年版《中国输血技术操作规程》中报道了血浆中亚甲蓝残留量检测方法，采用了固相萃取小柱对血浆样品和标准品中的亚甲蓝进行萃取分离，结合分光光度法测定其残留量。然而，在实际应用中发现该方法存在两个显著的缺点(1)操作特别烦琐、费时，血浆消耗量大；(2)样本测定吸光度值特别低，通常小于0.01 ;这与《中华人民共和国药典》“附录IV A紫外-可见分光光度法”项下所规定的准确测定含量所需要的吸光度0.3、. 7比较，所测定残留量显然是不准确的。而事实上，在低残留量时，吸光度的重现性特别差，预示着测定结果的不可靠。这一点与文献报道也是一致的。对于通常的亚甲蓝残留量为0.13umol/L(微摩尔/升)时，杨夏等[病毒灭活血浆亚甲蓝含量的检测及质量控制，中国输血杂志，2011，24 =881-883]的方法测定，其吸光度应为0. 0076，白莉等[固相萃取法检测病毒灭活血浆中的亚甲蓝，医药论坛杂志，2010，31 =108-109]的方法测定，其吸光度应为0.0042，张淑琴等[血浆中亚甲蓝含量的检测，临床输血与检验，2010，12 36-38]的方法测定，其吸光度应为0. 0011。由上可见，对于实际样本，这些吸光度值均是如此之低，显然，固相萃取一紫外可见分光光度法测定结果的可靠性极低。针对上述问题，周群刚等[文献I : P -环糊精增敏荧光分光光度法检测血浆亚甲蓝，临床检验杂志，2011，29 (5) =344-345]公开了一种P _环糊精增敏荧光分光光度法测定血浆中光敏剂亚甲蓝，相对于上述方法，该方法明显克服了上述两个缺点。但是，该方法能准确检测的最低定量限为0. 089 iimol/L，即略低于通常的亚甲蓝残留量(目前，对于通常使用的 成套病毒灭活袋，其亚甲蓝残留通常在0. 13umol/L左右)。事实上，实际血浆样本中最低残留量往往会低于0. 089 u mol/L,如文献2 [亚甲蓝/光化学法在血浆病毒灭活中应用，中国公共卫生，2008,24(11)，1365]中提到该研究中亚甲蓝的最终残留量为0.071.621! mol/L (文章第四段)。况且，从长远分析，随着技术的发展和人们对血浆要求的提高，亚甲蓝残留量将会越来越低。这显然会导致文献I中的方法失效，无法用于血浆亚甲蓝残留的常规检控。因此，开发，以进一步降低检测限，并提高检测灵敏度，具有积极的现实意义。
技术实现思路
本专利技术目的是提供，以进一步降低检测限，并提闻检测灵敏度。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是，包括如下步骤 (a)向空白血浆中加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，使其浓度为f4.5mmol/L，定容，得血浆空白样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得荧光峰强度或荧光峰面积为Fo ； (b)向空白血浆中加入定量的亚甲蓝溶液，并加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，加入浓度与上述血浆空白样本相同，定容，得含亚甲蓝浓度为Cs的血浆标准样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得荧光峰强度或荧光峰面积为Fs ； (C)向含亚甲蓝的待测血浆样本中加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，加入浓度与上述血浆空白样本相同，定容，得含亚甲蓝浓度为Cx的血浆待测样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得荧光峰强度或荧光峰面积为Fx ； 然后按对照品比较法计算即可得到待测血浆样本中的亚甲蓝浓度Cx ； 所述步骤(a)、(b)和(C)中采用的荧光分光光度计进行检测的条件相同，激发波长为665±8nm，发射波长扫描范围为67(T715nm，激发狭缝宽度2 10nm，发射狭缝宽度2 10nm，扫描速度100 1000nm/min,激发光程2 IOmm,发射光程2 10mm。上文中，所述向空白血浆中加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，使其浓度为1^4. 5mmol/L,这里的浓度是指加入羧甲基-P -环糊精饱和溶液之后的血浆中的羧甲基-￠-环糊精的摩尔浓度。上述技术方案中，所述步骤(a)、(b)和(C)中的定容采用缓冲液或二蒸水进行，所述PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液或磷酸二氢钠缓冲液。优选的，所述缓冲液为PBS缓冲液。其pH值为7. 2。与之相应的另一种技术方案，，包括如下步骤 (a)向至少5个空白血浆中分别加入不同量的亚甲蓝溶液，并加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，加入浓度与上述血浆空白样本相同，定容，得含亚甲蓝系列浓度的血浆标准样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得一系列荧光峰强度或荧光峰面积；(b)向含亚甲蓝的待测血浆样本中加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，加入浓度与上述空白血浆样本相同，定容，得含亚甲蓝浓度为Cx的血浆待测样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得荧光峰强度或荧光峰面积为Fx ； 按标准曲线法计算即可得到待测血浆样本中的亚甲蓝浓度Cx ； 所述步骤(a)和(b)中采用的荧光分光光度计进行检测的条件相同，激发波长为665±8nm，发射波长扫描范围为67(T715nm，激发狭缝宽度2 10nm，发射狭缝宽度2 lOnm，扫描速度IOO lOOOnm/min,激发光程2 IOmm,发射光程2 10mm。上述技术方案中，在步骤(a)之前，还进行如下步骤(C):向空白血浆中加入羧甲基-P -环糊精饱和溶液，使其浓度为广4. 5mmol/L,定容，得血浆空白样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得荧光峰强度或荧光峰面积为Fo。 上文中，所述向空白血浆中加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，使其浓度为1^4. 5mmol/L,这里的浓度是指加入羧甲基-P -环糊精饱和溶液之后的血浆中的羧甲基-￠-环糊精的摩尔浓度。上文中，按标准曲线法计算待测血浆样本中的亚甲蓝浓度时，其中的荧光信号可以扣除基底，也可以不扣除基底。上述技术方案中，所述步骤(a)、(b)和(C)中的定容采用缓冲液或二蒸水进行，所述缓冲液为PBS缓冲本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测血浆中亚甲蓝含量的方法，其特征在于，包括如下步骤 (a)向空白血浆中加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，使其浓度为f4.5mmol/L，定容，得血浆空白样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得荧光峰强度或荧光峰面积为Fo ； (b)向空白血浆中加入定量的亚甲蓝溶液，并加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，加入浓度与上述血浆空白样本相同，定容，得含亚甲蓝浓度为Cs的血浆标准样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得荧光峰强度或荧光峰面积为Fs ； (C)向含亚甲蓝的待测血浆样本中加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，加入浓度与上述血浆空白样本相同，定容，得含亚甲蓝浓度为Cx的血浆待测样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得荧光峰强度或荧光峰面积为Fx ； 然后按对照品比较法计算即可得到待测血浆样本中的亚甲蓝浓度Cx ； 所述步骤(a)、(b)和(C)中采用的荧光分光光度计进行检测的条件相同，激发波长为665±8nm，发射波长扫描范围为67(T715nm，激发狭缝宽度2 10nm，发射狭缝宽度2 10nm，扫描速度100 1000nm/min,激发光程2 IOmm,发射光程2 10mm。2.根据权利要求I所述的检测血浆中亚甲蓝含量的方法，其特征在于所述步骤(a)、(b)和(c)中的定容采用缓冲液或二蒸水进行，所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液或磷酸二氢钠缓冲液。3.根据权利要求2所述的检测血浆中亚甲蓝含量的方法，其特征在于所述缓冲液为PBS缓冲液。4.一种检测血浆中亚甲蓝含量的方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢洪平，周群刚，谢莲，唐建华，方敏，徐军，王明元，
申请(专利权)人：苏州市中心血站，苏州大学，
类型：发明
国别省市：
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