本发明专利技术公开了一种橡胶树乳管表达的多酚氧化酶、其编码基因及应用。该多酚氧化酶基因可在橡胶树的乳管细胞中表达，具有序列表中SEQ?ID?NO：1的序列，命名为HbPPO1。HbPPO1编码600个氨基酸，具有序列表中SEQ?ID?NO：2的序列，其分子量约为68kDa，等电点约为8.45，带电荷数约为7.96，碱性蛋白；该酶或其衍生蛋白至少可用于食品和工业领域中漂白或氧化有色物质；利用该基因的部分或全部序列反义表达至少可抑制橡胶树组培中的褐化现象以及延长橡胶树的排胶时间，从而提高橡胶产量；利用该基因或经过一个或几个碱基对的替代和/或插入和/或缺失而获得的功能性衍生基因过量表达至少可以提高橡胶树的抗病虫能力。
Polyphenol oxidase expressed in rubber tree milk pipe, coding gene and application thereof
The invention discloses a polyphenol oxidase expressed in a rubber tree milk pipe, a coding gene and an application thereof. The polyphenol oxidase gene can be expressed in the milk duct cells of Hevea brasiliensis and has the sequence of SEQ, ID, and NO:1 in the sequence table, named HbPPO1. HbPPO1 encoding 600 amino acids, with SEQ in the sequence table? ID? NO:2 sequence, its molecular weight is about 68kDa. The isoelectric point was about 8.45 and the charge number is about 7.96, the basic protein; enzyme or protein derivative can be used at least or oxidation colored material bleaching food and industrial fields; the some or all of the sequence gene antisense expression at least browning inhibition of rubber tree in tissue culture and discharging time extension of rubber tree, so as to improve the rubber yield; using the gene or by one or several base pair substitution and / or insertion and / or lack of acquired functional derivatives of gene overexpression at least can improve the rubber tree pest and disease resistance.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种橡胶树乳管表达的多酚氧化酶、其编码基因及应用。
技术介绍
天然橡胶(顺-1，4-聚异戊ニ烯)是ー种重要的エ业原料，其主要来源为巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell. Arg.)。天然橡胶因其生产具有明显的区域性、产品具有不可替代和市场易操纵等特点而成为ー种重要的战略物资。我国是世界第一大天然橡胶消费国，年消费量高达350万吨，然而，由于宜胶土地面积有限，我国年产胶量不到70万吨，自给率不到1/5。在宜胶土地资源有限的情况下，要提高我国天然橡胶的总产、提高単位面积土地的生产效益和产业竞争力，就必须大幅提高单位面积的橡胶产量。 影响橡胶单产的因素很多，其中，品种居所有因素之首。一直以来，橡胶生产国都非常注重优良品种的选育。亚洲地区种植的橡胶树品种主要源于魏克汉(Wickham)种质，遗传背景极其狭窄，加上花期不同步、非生产期长(在6年以上)、高度杂合化、育种周期长(从开始选育到性状鉴定一般超过30年)等特点，橡胶树育种进展非常缓慢。随着分子生物学技术的快速发展，利用组织培养技术对性状优良的单株进行扩繁或利用转基因技术定向改良为拓展橡胶树的遗传范围、加速育种进程提供了条件。因而，积极展开分离和鉴定有利性状相关的功能基因具有重要的理论和应用价值。多酹氧化酶(Polyphenol Oxidase, PP0)是一类广泛分布于动物、植物、真菌和细菌中的含铜氧化还原酶。在O2存在下，PPO可催化单酚羟基化为邻ニ酚，ニ羟酚氧化为邻醌。广义的PPO包含漆酶(laccase, EC. I. 10. 3. I)、酪氨酸酶(tyrosinase,或单酹氧化酶，monophenolase, EC. I. 14. 18. I)和儿茶酌·氧化酶(catechol oxidse,或双酌·氧化酶，o-diphenoloxidase, EC. I. 10. 3. 2)。一般所说的PPO是指儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。儿茶酚氧化酶是植物中主要存在的ΡΡ0，它由核基因编码，大多植物中以多个基因家族形式存在。PPO通常以无活性的前体形式存在，该前体一般由N-端导肽(transitpeptide)、中间高度保守的Cu结合区及C-端疏水区组成。导肽具有叶绿体定位蛋白的典型特征，它可引导PPO前体蛋白定位到叶绿体的类囊体和其它类型质体的基质中。Cu结合区是功能区，该区域6-7个高度保守的组氨酸(His)和I个半胱氨酸(Cys)残基对于其酶活性是必需的。晶体结构显示，两组His残基(每组3-4个)分别可与ー个Cu以配位键形式相连，从而形成具有特定三维结构(Type_3copper bridged)的活性部位。疏水性的C-端只在前体中存在，常由几个链形成反向平行的折叠，它可与Cu结合，可能与PPO三维结构的形成及酶活性有夫。PPO基因的表达特性比较复杂，不同家族成员在不同组织、不同发育时期及不同环境条件下呈现出不同表达模式，并且不同成员的底物特异性明显不同。PPO基因可被机械损伤、病原物侵染、植食性昆虫取食为害、虫害诱导挥发物及茉莉酸、水杨酸等防御反应信号分子处理诱导。除參与植物病原物侵染及虫害等防御反应外，PPO是水果、蔬菜等农产品发生有害褐变的主要原因。最近的研究还显示，产胶植物蒲公英乳管细胞中表达的PPO还參与了胶乳的褐化与凝固(Wahler D, Gronover CS, Richter C, Foucu F, Twyman RM,Moerscnbacher BM,Fischer R,Muth J,Priifer D.Polyphenoioxidase silencing affectslatex coagulation in Taraxacum species. Plant Physiol,2009,151 (I) :334-346)。橡胶树中，在自然条件下，胶乳流出一定时间后会自动凝固，长时间后会发生褐变，这表明橡胶树的胶乳中同样存在PP0。1972年，Coup6等首次证实橡胶树的胶乳中存在 PPO 沾性(CoupeM, Pujarniscle S, d’Auzac J. Compartimentation de diversesoxydo-reductases(peroxydase, o-aiphenol-oxydase et malate deshydrogenase)dansIe latex d’Hevea brasiliensis(Kunth). Miill Arg Physiologie Vegetale,1972,10 459-464);后面，Wititsuwannakul 等对相关蛋白进行了分离纯化(Wititsuwannakul D,Chareonthiphakorn N, Pace M, Wititsuwannaku丄 R. Polyphenol oxidases from latexof Hevea brasiliensis-purification and characterization. Phytochemistry,2002,61(2) :115-121)。研究发现，胶乳中的PPO活性主要位于胶乳超速离心后的B-乳清(主要为黄色体，Iutoid)和F-W复合体(Frey-Wyssling complex),其中，黄色体中的酶活性是F-W复合体的5-34倍；相反，C-乳清和橡胶粒子层的酶活性很低；不同品系的PPO活性差异明显，抗病能力强、胶乳及其产品易褐化的GTl的PPO活性较高。虽然如此，然而至今还未见该类酶编码基因及其蛋白序列的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供ー种橡胶树乳管表达的多酚氧化酶、其编码基因及应用。本专利技术提供的多酚氧化酶，最初来自于大戟科橡胶树属巴西橡胶树(Heveabrasiliensis Muell. Arg.),名称为 HbPPOl,是如下(I)或(2)的蛋白质(I)由序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸序列组成的蛋白质，其分子量约为68kDa，等电点约为8. 45，带电荷数约为7. 96，碱性蛋白；(2)由序列表中SEQ ID NO 2的序列经过ー个或几个氨基酸残基的替代和/或插入和/或缺失且具有多酚氧化酶活性的衍生蛋白质。序列表中SEQ ID NO 2的序列由600个氨基酸残基组成。所述ー个或几个氨基酸残基的替代和/或插入和/或缺失是指不超过10个氨基酸残基的替代和/或插入和/或缺失。上述(I)中的HbPPOl可从巴西橡胶树的芽、叶片、种子、愈伤、悬浮细胞及乳管细胞等组织或细胞中分离、纯化，优先推荐割胶获得的胶乳；同时也可以从利用HbPPOl的编码基因获得的转基因材料中分离、純化。上述(2)中的HbPPOl可人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达得到；所述的编码基因是指通过ー个或几个碱基的替代和/或插入和/或缺失获得的且其编码蛋白质具有多酚氧化酶活性的衍生基因。所述HbPPOl的编码基因也属于本专利技术的保护范围。 所述HbPPOl的编码基因为如下(I)、(2)或(3)的核苷酸序列(I)序列表中SEQ ID NO 1的核苷酸序列；(2)由序列表中SEQ ID NO 1的核苷酸序列经过ー个或几个碱基对的替代和/或插入和/或缺失而获本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー种橡胶树乳管表达的多酚氧化酶，其特征在于是如下⑴或⑵的蛋白质 (1)由序列表中SEQID NO 2的氨基酸序列组成的蛋白质，其分子量为68kDa，等电点为8. 45，带电荷数为7. 96，碱性蛋白； (2)由序列表中SEQID NO :2的序列经过ー个或几个氨基酸残基的替代和/或插入和/或缺失且具有多酚氧化酶活性的衍生蛋白质。2.权利要求I所述橡胶树乳管表达的多酚氧化酶的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下(1)、(2)或(3)的核苷酸序列(1)序列表中SEQID NO : I的核苷酸序列； (2)由序列表中SEQID NO:I的核苷酸序列经过ー个或几个碱基对的替代和/或插入和/或缺...
【专利技术属性】
技术研发人员：邹智，杨礼富，王真辉，袁坤，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院橡胶研究所，
类型：发明
国别省市：
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