与四氢黄豆苷元合成有关的酶制造技术

本发明专利技术的目的在于提供一种与四氢黄豆苷元合成相关的酶、编码上述酶的基因、及使用上述酶和基因制备四氢黄豆苷元的方法。本发明专利技术提供二氢黄豆苷元合成酶、四氢黄豆苷元合成酶及雌马酚合成酶和编码上述酶的基因。并且，本发明专利技术提供一种使用上述酶合成二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种具有以黄豆苷元为底物合成二氢黄豆苷元活性的多肽、一种具有以二氢黄豆苷元为底物合成四氢黄豆苷元活性的多肽、及一种具有以四氢黄豆苷元为底物合成雌马酚活性的多肽，并且涉及一种编码上述多肽的多核苷酸。并且，本专利技术涉及一种使用上述多肽制备二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及雌马酚的制备方法及在上述过程中使用的制备装置，本专利技术还提供一种与上述内容相关的技术。
技术介绍
一直以来，通常认为异黄酮衍生物具有多种生理学和药学活性，被用作食品原料和药品原料。但是，随着与异黄酮衍生物有关的功能的阐明，有报道指出并不是一直以来所认为的仅异黄酮衍生物具有雌激素样活性，而是上述衍生物在各种肠内细菌的作用下在菌体内被代谢(生物合成)后生成了具有更强雌激素样作用的雌马酚，上述雌马酚被释放到菌体外，之后被肠吸收而在全身发挥雌激素作用。然而，并非所有人都有在肠内产生雌马酚的能力，雌马酚的产生能力因人而异。例如，有些人在肠内没有雌马酚产生菌，而有些人虽然在肠内有雌马酚产生菌但其雌马酚产生能力较低。因此，在体内有效利用雌马酚对于面临高龄化社会的日本等是重要的，特别是从应对以骨质疏松为代表的慢性老年性疾病方面考虑也是重要的。并且，考虑到如上所述的有些人内在地含有雌马酚产生肠内细菌而有些人却没有的这一现实，需要研制一种能有效地人工生产雌马酚的雌马酚合成原料。在上述背景下，从提供一种雌马酚合成原料这方面考虑，与上述生物合成通路有关的酶的鉴定及其使用是极其重要的。但是，对于生产或催化在上述生物合成通路中相关的几个中间体的酶，尚无任何相关信息，因此人们期望能够鉴定相关酶。专利文献I :日本特开2006-296434号公报
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种与用作雌马酚合成原料的二氢黄豆苷元的合成有关的酶。具体而言，本专利技术的目的在于提供具有以黄豆苷元为底物合成二氢黄豆苷元活性的多肽。并且，本专利技术的目的在于提供编码上述多肽的多核苷酸及与利用该多肽合成二氢黄豆苷元相关的技术等。另外，本专利技术的目的在于提供与用作雌马酚合成原料的四氢黄豆苷元的合成有关的酶。具体而言，本专利技术的目的在于提供具有以二氢黄豆苷元为底物合成四氢黄豆苷元活性的多肽。并且，本专利技术的目的在于提供编码上述多肽的多核苷酸及与利用该多肽合成四氢黄豆苷元相关的技术等。进而，本专利技术的目的在于提供与雌马酚合成有关的酶。具体而言，本专利技术的目的在于提供具有以四氢黄豆苷元为底物合成雌马酚活性的多肽。并且，本专利技术的目的在于提供编码上述多肽的多核苷酸及与利用该多肽合成雌马酚相关的技术等。进而，本专利技术的目的在于提供在由黄豆苷元制备雌马酚时所生成的二氢黄豆苷元和四氢黄豆苷元的制备方法即中间体的制备方法，及能够利用所得的中间体制备雌马酚的制备方法。并且，本专利技术的目的在于提供在上述制备中使用的制备装置。本专利技术人等为了解决上述课题进行了潜心研究，结果成功地从雌马酚产生肠内细菌中分离出能够合成二氢黄豆苷元的酶、能够合成四氢黄豆苷元的酶及能够合成雌马酚的酶，用作合成雌马酚的原料，并阐明了上述酶的结构。另外，本申请专利技术人等通过进一步的研究，利用上述酶成功地人工制备出二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及雌马酚。基于上述发现并经过进一步改良完成了本专利技术。 gp，本专利技术提供下述专利技术项AL选自以下(Aa) (Ac)中的多肽(Aa)多肽，由序列号I所示的氨基酸序列组成；(Ab)多肽，由在序列号I所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸得到的氨基酸序列组成，并且具有以黄豆苷元为底物合成二氢黄豆苷元的活性；(Ac)多肽，由与序列号I所示的氨基酸序列具有60%以上同一性的氨基酸序列组成，并且具有以黄豆苷元为底物合成二氢黄豆苷元的活性。项A2.选自以下(Ad) (Af)中的多核苷酸(Ad)多核苷酸，由序列号4所示的核苷酸序列组成；(Ae)多核苷酸，编码由序列号I所示的氨基酸序列组成的多肽；(Af)多核苷酸，与上述(Ad)或(Ae)的多核苷酸的互补链在严格条件下杂交，并且编码具有以黄豆苷元为底物生成二氢黄豆苷元活性的多肽。项A3. —种表达载体,含有项A2所述的多核苷酸。项A4. —种重组细胞，是由项A3所述的表达载体转化得到的。项A5.如项A4所述的重组细胞,该重组细胞为细菌性原核细胞。项A6.如项A5所述的重组细胞，其中，细菌性原核细胞属于乳球菌属。项A7. —种多肽的制备方法，所述方法包括培养项A4至A6中任一项所述的细胞，得到具有以黄豆苷元为底物生成二氢黄豆苷元活性的多肽的步骤。项A8. —种多肽，由项A7所述的制备方法得到。项A9. —种二氢黄豆苷元的制备方法，所述方法包括使项Al或AS所述的多肽、及NADPH及/或NADH作用于黄豆苷元的步骤。项A10. —种二氢黄S 苷兀的制备方法,所述方法包括使项A4至A6中任一项所述的细胞作用于黄豆苷元的步骤。项All. —种抗体，所述抗体与项Al所述的多肽或由项A2所述的多核苷酸编码的多肽具有亲和性。项A12. —种免疫学方法，用于检测或测定项Al所述的多肽或由项A2所述的多核苷酸编码的多肽，所述方法包括使受试样品与项All所述的抗体相接触的步骤。项A13.如项A12所述的方法，其中，用作检测或测定对象的多肽存在于细菌性原核细胞内。项A14. —种探针，所述探针含有能与编码项Al所述多肽的多核苷酸或项A2所述多核苷酸在严格条件下杂交的核苷酸序列。项A15. —种引物，所述引物含有能与编码项Al所述多肽的多核苷酸或项A2所述多核苷酸在严格条件下杂交的核苷酸序列。项A16. —种使用项A14所述的探针检测或测定编码项Al所述的多肽的多核苷酸或项A2所述的多核苷酸的方法。项A17.如项A16所述的方法，其中，用作检测或测定对象的多肽存在于细菌性原核细胞内。 项A18.如项A16所述的方法，包括使用PCR扩增全部或部分编码Al所述多肽的多核苷酸或项A2所述的多核苷酸的步骤。项A19. —种二氢黄豆苷元合成酶组合物，其特征在于，含有项Al所述的多肽或项A2的多核苷酸编码的多肽。项A20.如项A19所述的组合物，所述组合物进一步含有NADPH及/或NADH。项A21. —种二氢黄豆苷兀合成原料组合物,其特征在于,含有(Ai)项Al所述的多肽或项A2的多核苷酸编码的多肽； (Aii) NADPH 及 / 或 NADH ;及(Aiii)黄豆苷元。项A22. —种二氢黄豆苷兀合成原料组合物,其特征在于,含有(Aiv)项A4至A6中任一项所述的细胞；及(Aiii)黄豆苷元。项A23. —种二氢黄豆苷兀合成用试剂盒,所述试剂盒含有(Ai)项Al所述的多肽或项A2的多核苷酸编码的多肽；(Aii) NADPH 及 / 或 NADH ;及(Aiii)黄豆苷元。项A24. —种二氢黄豆苷兀合成用试剂盒,所述试剂盒含有(Aiv)项A4至A6中任一项所述的细胞；及(Aiii)黄豆苷元。项A25. —种免疫学测定用试剂盒，用于测定项Al所述的多肽或项A2的多核苷酸编码的多肽，所述试剂盒至少含有项All所述的抗体。项A26. —种PCR用试剂盒，用于检测编码项Al所述多肽的多核苷酸或项A2所述的多核苷酸，所述试剂盒至少含有项A15所述的引物。项A27.如项A26所述的鉴定用试剂盒，所述试剂盒用于鉴定含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
2007.12.27 JP 2007-336227;2008.03.05 JP 2008-054871.一种多肽,所述多肽具有以ニ氢黄豆苷兀为底物合成四氢黄豆苷兀的活性。2.如权利要求I所述的多肽，所述多肽以NADPH或NADH作为辅酶显示所述活性。3.如权利要求I或2所述的多肽，所述多肽的最适温度在37°C左右。4.如权利要求I 3中任一项所述的多肽,所述多肽的最适pH为4.5。5.如权利要求I 4中任一项所述的多肽，所述多肽通过SDS-PAGE測定的分子量约为29kDa。6.如权利要求I 5中任一项所述的多肽，所述多肽为来自拟杆菌、链球菌、或乳球菌的多肽。7.如权利要求I 6中任一项所述的多肽，所述多肽为下述(Ba) (Be)中的任ー种多肽 (Ba)多肽，由序列号7所示的氨基酸序列组成； (Bb)多肽，由在序列号7所示的氨基酸序列中，取代、缺失、插入及/或添加选自下述位置的I 15个氨基酸得到的氨基酸序列组成，并且具有以ニ氢黄豆苷元为底物合成四氢黄豆苷元的活性， 所述位置为第7位的缬氨酸、第8位的脯氨酸、第26位的缬氨酸、第36位的亮氨酸、第46位的精氨酸、第94位的天冬氨酸、第101位的谷氨酸、第126位的甘氨酸、第137位的异亮氨酸、第156位的谷氨酰胺、第157位的赖氨酸、159位的天冬氨酸、第160位的甘氨酸、第171位的丙氨酸、第185位的半胱氨酸、第221位的丝氨酸、第233位的丙氨酸、第241位的缬氨酸、第258位的丝氨酸、第266位的异亮氨酸、及第286位的缬氨酸、及它们的前后3个的氨基酸的位置； (Be)多肽，由与序列号7所示的氨基酸序列具有93%以上同一...

【专利技术属性】
技术研发人员：岛田良和，保田世津子，高桥真行，林隆史，宫泽宪浩，阿比留康弘，大谷直明，佐藤几太郎，
申请(专利权)人：大塚制药株式会社，
类型：发明
国别省市：