本发明专利技术公开了一种非基因型依赖橡胶树自根无性系离体繁殖的方法，包括体胚植株的诱导过程、芽条消毒过程、室内嫁接过程、室内嫁接快繁过程和芽条诱导生根过程。本发明专利技术工艺流程简单，生产成本低，借助嫁接技术非基因型依赖性，通过循环嫁接繁殖橡胶树自根无性系和砧木自根无性系，有助于砧木选育种，实现了一次取材就可实现自根无性系的循环繁殖，克服了常规方法不断采集外植体的缺点，解决了常规巴西橡胶树砧木自根无性系增殖效率低下、受基因型影响的难题，为橡胶树不同基因型砧木自根无性系大规模扩繁增殖提供了高效的技术支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物细胞工程
，具体涉及一种非基因型依赖 橡胶树自根无性系离体繁殖的方法。
技术介绍
天然橡胶为四大工业原料之一，也是极为重要的战略资源。目前，在自然界大约2000余种产胶植物中，商品天然胶约99%来源于巴西橡 胶树(Heveabrasiliensis)。目前，大田种植的橡胶树无性系均为嫁接 苗，即由砧木和芽条组成，这些砧木均为未经选择的实生苗。现在研 究表明砧木对芽条产量、生长速度、抗逆等性状表现均有影响，因此 砧木良种化将推动橡胶树无性系良种化。目前，橡胶树自根无性系繁殖主要有两种方法。 一是通过橡胶树 的胚胎发生和植株再生，这种方法主要有两种途径获得花药和内珠 被培养。其基本过程是1)剥取单核靠边期花药或幼嫩种子内珠被 进行愈伤组织诱导培养，约40 60天；2)将愈伤组织转入体胚发生培 养基，进行体细胞胚胎发生诱导，约10 30天；3)经体胚发生诱导后， 部分愈伤上会出现球形胚、子叶形胚等胚状体；4)将成熟的子叶形 胚转入植株再生培养基上进行植株再生。这种方法需要不断的从大田 中采集外植体，受到环境、气候、季节、病害等影响。另一种方法是 从大田取芽条消毒，诱导芽条抽芽，再以这些无菌芽条为材料通过离体微繁技术进行扩繁，即将通过上述途径获得的自根无性系的茎干切 成几段，每一段都带有一个茎干芽，通过适当条件的培养诱导芽萌发， 从而实现无性系繁殖的目的。目前报道的结果显示两种方法的最大限 制因素是基因型的限制，对于繁殖多种基因型无性系材料，这两种方 法可能需要建立多种培养体系，培养体系的优化将耗费大量的时间和 人力，这将严重制约砧木选育和砧木繁育进程。为此，必须建立能大量的、持续的、长期的、可快速扩繁、非基 因型依赖的自根无性系的技术体系，为砧木选育提供多种基因型育种 材料，推动砧木良种化研究和砧木良种化。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种非基因型依赖橡胶树自根无性系离体 繁殖的方法。本专利技术所采用的技术方案，包括体胚 植株的诱导过程、芽条消毒过程、室内嫁接过程、室内嫁接快繁过程 和芽条诱导生根过程，其步骤是1、体胚植株的诱导过程1)、以巴西橡胶树花蕾为外植体，将花蕾进行表面消毒后剥出花 药，将花药接种到诱导愈伤的诱导培养基上进行暗培养40 60天。所述诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并将其中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰和七水硫酸镁的含量修改为磷酸二氢钾425 mg/L、无水氯化钙260 mg/L、四水硫酸锰30. 31 mg/L、七水硫酸镁555 mg/L,再附加2，4-D 0. 5 3mg/L、 KT 0. 5 3mg/L、 NAA 0. 5~3mg/L、 Phytgel 2~3g/L、蔗糖50~90g/L、椰子水50ml/L。2) 、将诱导后的愈伤组织接种到胚胎发生的胚胎培养基上进行暗 培养40~60天得到胚状体。所述胚胎培养基是以MS培养基为基础培 养基，并将其中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰和七水硫酸 镁的含量修改为磷酸二氢钾425mg/L、无水氯化钙260mg/L、四水 硫酸锰30. 31 mg/L、七水硫酸镁555 mg/L，再附加2， 4-D 0. 5~3mg/L、 KT 0. 5~3mg/L、 NAA 0. 5 3mg/L、 Phytgel 2~3g/L、蔗糖50~90g/L。3) 、将得到的胚状体切成0.2 0.5cm的切块，并接种到诱导培养 基上进行暗培养40~60天；然后再接种到胚胎培养基上进行暗培养 40~60天，生成成熟子叶形胚。4) 、将成熟子叶形胚转移到出苗培养基上，每天16小时光照， 温度度为25 28"C，培养20天后开始出苗。所述出苗培养基是以MS 培养基为基础培养基，并将其中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫 酸锰和七水硫酸镁的含量修改为磷酸二氢钾425 mg/L、无水氯化韩 260 mg/L、四水硫酸锰30. 31 mg/L、七水硫酸镁555 mg/L，再附加 KT 0. 0 mg/L、 GA3 0. 5 3mg/L、 IAA0,5~4mg/L、蔗糖30~70g/L、 活性碳0. 5~3g/L、 Phytgel 2~4g/L、椰子水50ml/L。2、室外芽条消毒过程将室外茎粗2厘米左右芽条用75%酒精表面消毒30-60秒和0.1 %硝酸银消毒10~15分钟后，用200~500mg/LTicarxilin洗5分钟，最 后用无菌水冲洗3 6次，每次3 5分钟。3、 室内嫁接过程从消毒过芽条上切取长度为0. 5~1. 0厘米的芽片，去除芽片木质 部，以第一蓬真叶展叶期以前体胚植株为消毒芽片嫁接砧木进行嫁 接；将嫁接好的植株重新接种到出苗培养基上，每天16小时光照， 温度度为25~28°C,培养20-30天后，解除薄膜并剪掉芽片以上茎段， 继续在出苗培养基上，每天16小时光照，温度度为25 28"C，进行 培养。所述嫁接砧木是在体胚植株上开宽度为茎围1/4~2/5，长 1.3-1.5厘米的芽接口，芽接口下端离子叶1.0-1.5厘米，保留 0.3 0.7厘米的水囊皮，以备夹托芽片。4、 室内嫁接快繁过程从试管中取高3-7厘米、茎粗0. 2~0. 6厘米，叶子处于生长稳定 期或已落叶的嫁接苗抽出的芽条，切取长度为0. 5~0. 8厘米的芽片， 以第一蓬真叶展叶期以前体胚植株为嫁接砧木进行嫁接；将嫁接好的 植株重新接种到出苗培养基上，每天16小时光照，温度度为25~28 °C，培养20 30天后，解除薄膜并剪掉芽片以上茎段，继续在出苗培 养基上，每天16小时光照，温度为25 28'C，进行培养。5、 芽条诱导生根过程将快繁后嫁接苗的芽条剪下,在含有1 6mg/L IBA和0. l~0.5mg/L IM的溶液中浸泡3~10分钟，最后接种到不含生长激素体胚植株的 出苗培养基上，每天16小时光照，温度为25 28t:，进行培养至生 根。本专利技术工艺流程简单，生产成本低，借助嫁接技术非基因型依性，通过循环嫁接得以繁殖橡胶树自根无性系，繁殖橡胶树砧木自根 无性系，有助于砧木选育种，实现了一次取材就可实现自根无性系的 循环繁殖，克服了常规方法不断采集外植体的缺点。具体实施方式 下面用非限定性实施例对本专利技术作进一步说明。 实施例，具体步骤是1、体胚植株的诱导过程1. 1花药胚性愈伤组织诱导过程A、 以巴西橡胶树花蕾为外植体，将花蕾用75%酒精表面消毒30 秒后，再用0.1%氯化汞消毒15分钟，最后用无菌水冲洗3次，每 次5分钟。B、 将消毒好的花蕾中的雄蕊剥出，将其接种到诱导愈伤培养基， 培养基的有效成份为改良的MS培养基和附加成份，MS培养基中修改 的成份为磷酸二氢钾350 mg/L、无水氯化钙200 mg/L、四水硫酸锰 20 mg/L、七水硫酸镁400 mg/L，附加成份为2， 4-D 2mg/L、 KT lmg/L、 NAA 1,5mg/L、 Phytagel 2g/L、蔗糖80g/L、椰子水50ml/L。C、 暗培养，温度为28"C，培养40天； 1. 2初生胚状体诱导过程A、将诱导的愈伤组织接种到胚胎诱导培养基，培养基的有效成 份为改良的MS培养基和附加成份，MS培养基中修改的成份为磷酸二氢钾350 mg/L、无水氯化钙200 mg本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种非基因型依赖橡胶树自根无性系离体繁殖的方法，其特征在于：包括体胚植株的诱导过程、芽条消毒过程、室内嫁接过程、室内嫁接快繁过程和芽条诱导生根过程，步骤如下： １）、体胚植株的诱导过程 ①、以巴西橡胶树花蕾为外植体，将花蕾进行表面消毒后剥出花药，将花药接种到诱导愈伤的诱导培养基上进行暗培养４０～６０天；所述诱导培养基是以ＭＳ培养基为基础培养基，并将其中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰和七水硫酸镁的含量修改为磷酸二氢钾４２５ｍｇ／Ｌ、无水氯化钙２６０ｍｇ／Ｌ、四水硫酸锰３０．３１ｍｇ／Ｌ、七水硫酸镁５５５ｍｇ／Ｌ，再附加２，４－Ｄ ０．５～３ｍｇ／Ｌ、ＫＴ０．５～３ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ０．５～３ｍｇ／Ｌ、Ｐｈｙｔｇｅｌ ２～３ｇ／Ｌ、蔗糖５０～９０ｇ／Ｌ、椰子水５０ｍｌ／Ｌ； ②、将诱导后的愈伤组织接种到胚胎发生的胚胎培养基上进行暗培养４０～６０天得到胚状体；所述胚胎培养基是以ＭＳ培养基为基础培养基，并将其中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰和七水硫酸镁的含量修改为磷酸二氢钾４２５ｍｇ／Ｌ、无水氯化钙２６０ｍｇ／Ｌ、四水硫酸锰３０．３１ｍｇ／Ｌ、七水硫酸镁５５５ｍｇ／Ｌ，再附加２，４－Ｄ ０．５～３ｍｇ／Ｌ、ＫＴ ０．５～３ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ ０．５～３ｍｇ／Ｌ、Ｐｈｙｔｇｅｌ ２～３ｇ／Ｌ、蔗糖５０～９０ｇ／Ｌ； ③、将得到的胚状体切成０．２～０．５ｃｍ的切块，并接种到诱导培养基上进行暗培养４０～６０天；然后再接种到胚胎培养基上进行暗培养４０～６０天，生成成熟子叶形胚； ④、将成熟子叶形胚转移到出苗培养基上，每天１６小时光照，温度度为２５～２８℃，培养２０天后开始出苗；所述出苗培养基是以ＭＳ培养基为基础培养基，并将其中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰和七水硫酸镁的含量修改为磷酸二氢钾４２５ｍｇ／Ｌ、无水氯化钙２６０ｍｇ／Ｌ、四水硫酸锰３０．３１ｍｇ／Ｌ、七水硫酸镁５５５ｍｇ／Ｌ，再附加ＫＴ ０．１～１．０ｍｇ／Ｌ、ＧＡ３ ０．５～３ｍｇ／Ｌ、ＩＡＡ ０．５～４ｍｇ／Ｌ、蔗糖３０～７０ｇ／Ｌ、活性碳０．５～３ｇ／Ｌ、Ｐｈｙｔｇｅｌ ２～４ｇ／Ｌ、椰子水５０ｍｌ／Ｌ； ２）、室外芽条消毒过程 将室外茎粗２厘米左右芽条用７５％酒精表面消毒３０～６０秒和０．１％硝酸银消毒１０～１５分钟后，用２００～５００ｍｇ／ＬＴｉｃａｒｘｉｌｉｎ洗５分钟，最后用无菌水冲洗３～６次，每次３～５分钟； ３）、室内嫁接过程 从消毒过芽...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：华玉伟，黄华孙，黄天带，胡彦师，曾霞，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院橡胶研究所，
类型：发明
国别省市：66[中国|海南]
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