本发明专利技术属于生物技术领域，更具体涉及一种漆酶及其基因序列。所述漆酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。编码漆酶的基因为Lac1基因，该基因的cDNA序列如SEQIDNO.2所示。所述Lac1基因的全长序列如SEQIDNO.1所示。培养包含Lac1基因的细胞或经重组载体转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物。本发明专利技术利用基因工程手段实现了Lac1基因的活性表达。本发明专利技术的Lac1基因表达的漆酶在较宽的温度范围内都有酶活力，且具有良好的pH稳定性及热稳定性。本发明专利技术所产重组漆酶对靛类、偶氮类和二氨基三甲苯烷类染料有良好的脱色效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，更具体涉及一种漆酶及其基因序列。
技术介绍
漆酶(laccase，EC I. 10. 3. 2)是一种含铜的多酚氧化酶，在木质素的生物降解中起到重要的作用。白腐真菌被认为是目前最强、最主要的木质素降解者，能使木质素最终矿化为CO2和h2o。它们主要是通过分泌漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶等胞外氧化酶来实现木质素的降解。漆酶广泛存在于高等植物和真菌中。漆酶多为单体酶，且绝大多数真菌漆酶为分泌型糖蛋白。漆酶的底物范围很广，包括多种酚类化合物和芳香胺类化合物；此外，小分子介体可以进一步拓宽漆酶的底物范围。漆酶在印染废水处理、造纸工业、木材加工、生物能 源、食品加工、生物修复、有机合成等领域中有着广泛而重要的应用前景。工业废水中，纺织工业印染废水的污染最为严重，排放量大；并且，许多染料可能致畸变或癌变，严重威胁人类生存环境。由于染料自身特殊的化学结构复杂、品种繁多，往往不能有效地被凝结、臭氧、活性炭等单一技术处理，而且对一般微生物具有毒性，因此利用漆酶高效、环保地处理印染废水成为当前研究的热点。尽管漆酶具有如此重要的用途，漆酶生产效率低、酶学性质等因素限制了其在生产实践中的应用。要实现漆酶的应用价值，必须寻找质优价廉的酶源。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种漆酶及其基因序列，同时还提供产漆酶的基因工程菌株，扩展漆酶的基因库，为漆酶的产业化提供基础。本专利技术提供的一种漆酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。本专利技术提供的一种编码漆酶的基因，所述编码漆酶的基因为Lacl基因，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO. 2所示。所述Lacl基因的全长序列如SEQ ID NO. I所示。本专利技术还提供了一种所述的编码漆酶的基因的表达方法培养包含Lacl基因的细胞或经重组载体转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物。本专利技术的技术方案详述如下 本专利技术涉及从白腐真菌一色齿毛菌(Cferrma unicolorX參考嫌:张蓓蓓；一色齿毛菌胞外漆酶的纯化及部分酶学性质的研究[D].东北林业大学，2009. 6-10)中克隆的漆酶Lac I基因。本专利技术涉及从一色齿毛菌中克隆的Lacl的基因和cDNA序列。实施方式之一，本专利技术提取一色齿毛菌的基因组DNA，克隆得到包含漆酶4个铜结合区(CuI-CuIV)的保守序列片段后，通过反向PCR获得Lacl的基因序列，再通过RT-PCR获得Lacl的cDNA序列。所述基因序列包含如SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列，所述cDNA序列包含如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。SEQ ID NO. I中的DNA序列由2491个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第I位到第2491位碱基，包含2491个碱基对。该序列内含有11个内含子，分别为5’端第181位到第240位碱基，5’端第310位到第374位碱基，5’端第496位到第589位碱基，5’端第704位到第762位碱基，5’端第827位到第896位碱基，5’端第993位到第1102位碱基，5’端第1260位到第1337位碱基，5’端第1536位到1602位碱基，5’端第1660位到1764位碱基，5’端第1972到第2091位碱基，5’端第2327位到第2435位碱基。其cDNA序列如SEQ ID NO. 2，由1554个碱基组成。SEQ ID NO. 3由517个氨基酸残基组成，自N，端第1_20位氨基酸残基是信号肽序列；成熟酶为497个氨基酸残基。 本专利技术还涉及包含所述Lacl cDNA序列的重组载体，例如由各种本领域常用的表达载体制备的重组载体，其中，所述cDNA序列不包含其来源微生物的内源性信号肽序列。实施方式之一中，将不带内源性信号肽编码序列的LaclcDNA序列经通ol和油al双酶切后与通ol和油<31双酶切过的pPICZa C载体相连，得到毕赤酵母重组表达载体pPICZa -Laclo本专利技术还制备包含本专利技术Lacl编码序列的细胞。实施方式之一中，所述细胞是用上述本专利技术重组载体转化来构建的。所述细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用，例如酵母细胞。在本专利技术的实施方式之一中，选用毕赤酵母构建表达Lacl的重组细胞。本专利技术还提供了表达Lacl的方法，包括培养所述本专利技术包含Lacl编码序列的细胞或所述经转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物。本专利技术利用基因工程手段实现了 Lacl基因的活性表达。本专利技术通过酶学性质鉴定进行了表达的重组漆酶的最适作用温度、最适作用pH、温度稳定性及pH稳定性的分析，证明本专利技术的Lacl基因表达的漆酶在较宽的温度范围内都有酶活力，且具有良好的pH稳定性及热稳定性。本专利技术所产重组漆酶对靛类、偶氮类和二氨基三甲苯烷类染料有良好的脱色效果。附图说明图I为毕赤酵母表达的重组Lacl的发酵过程中的酶活力。图2 为重组 Lacl 的 Native-PAGE 分析。图3为毕赤酵母表达的重组Lacl的最适反应pH。图4为毕赤酵母表达的重组Lacl的pH稳定性。图5为毕赤酵母表达的重组Lacl的最适反应温度。图6为毕赤酵母表达的重组Lacl的温度稳定性。图7为毕赤酵母表达的重组Lacl的共培养脱色。图8为重组Lacl对靛蓝的脱色。图9为重组Lacl对酸性紫7的脱色。图10为重组Lacl对孔雀绿的脱色。图11为不同浓度曲酸对漆酶酶活的抑制。具体实施例方式以下根据具体的实施例充分说明本专利技术，但是本专利技术不仅限于此。I.菌株和载体 菌株来源于白腐真菌一色齿毛菌(Cferreaa uni color)(参考文献张宿宿；一色齿毛菌胞外漆酶的纯化及部分酶学性质的研究[D].东北林业大学，2009. 6-10)，以下将其命名为菌株HYB07，大肠杆菌T0P10、克隆载体PMD18-T购自TaKaRa公司，毕赤酵母G0ZcAiapas tor is) X-33、表达载体 pPICZ a -C 购自 Invitrogen 公司。2.试剂 限制性内切酶、DNA Marker、蛋白质Marker、Taq酶、Ex Taq酶、T4连接酶等购自TaKaRa 公司，Pfu聚合酶购自Fermentas公司，2, 2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑_6_磺酸)(ABTS)购自SIGMA公司，其他试剂购自上海生工或者进口。3.培养基 LB、LLB培养基，YPD、YPDS, BMMY等培养基均参照Invitrogen毕赤酵母操作手册。高氮低碳高无机盐(LM3)发酵培养基 每50mL中含200g/L葡萄糖溶液2. 5mL,22. Og/L 酒石酸铵 10. OmL,大量元素液 15. OmL,微量元素液 15. OmL, 100mg/L VB1 3. OmL,ddH20 4. 5mL0大量元素液每升含KH2PO4 20. 0g MgSO4. 7H20 13. 8g，CaCl2 I. Og 和 NaCl 0. 6g。微量元素液每升含 MnSO4. H2O 0. 35g，FeSO4. 7H20 60mg，CoCl2. 6H20 IIOmg, ZnSO4. 7H2060mg，CuSO4. 5H20 95 mg, KAl (SO4)2. 12H20 6mg，H3本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种漆酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。2.一种编码漆酶的基因，其特征在于所述编码漆酶的基因为Lacl基因，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO. 2所示。3.根据权利要求2所述的编码漆酶的...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨捷，阮秋莲，林娟，叶秀云，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：
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