荧光免疫测定方法技术

本发明专利技术的课题在于提供一种免疫测定方法，其不需要固相化步骤和洗涤步骤，能够在液相中快速且简易地进行目标物质的定量测定，并且能够使抗原可见化。通过如下方式解决该课题：依次进行下述(a)~(c)的步骤来测定受试物质中存在的目标抗原的浓度：(a)在液相中，使抗体轻链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体重链可变区多肽与受试物质中的抗原接触，或者在液相中，使抗体重链可变区多肽和由荧光色素标记的抗体轻链可变区多肽与受试物质中的抗原接触；(b)测定所述荧光色素的荧光强度；(c)以液相中的抗原浓度与所述荧光色素的荧光强度存在正相关关系为指标，计算出受试物质中含有的抗原量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及不需要固相化步骤和洗涤步骤的新的抗原浓度測定方法和用于实施该抗原浓度測定方法的试剂盒等。
技术介绍
測定抗原或抗体的浓度的方法中，在临床诊断、基础研究和环境调查等中使用最广泛的測定方法是使用识别同一抗原的不同表位的2种单克隆抗体或者使用单克隆抗体与多克隆抗体的、称为夹心ELISA法(或夹心RIA法)的免疫測定方法。夹心法的详情如下所述。作为第一阶段，将称为一次抗体的单克隆/多克隆抗体固定在測定用板上，向其中注入含有抗原的样本，反应一定时间而使抗体与抗原結合。接着，作为第二阶段，使用洗涤液将与抗体结合的杂质和非特异性结合在板上的抗原洗涤除去。作为第三阶段，注入预先结合有酶、荧光色素或放射性同位素等报告分子的标记二次抗体溶液，反应一定时间，使被 一次抗体填补的抗原上进ー步结合标记二次抗体。反应后，使用洗涤液除去多余的标记抗体，利用酶活性、荧光或放射性同位素等对结合在測定用板上的报告分子的量进行測定，由此测定样本中的抗原量。如上所述，通常的夹心ELISA法中，需要使用表位不同的2种抗体，但在例如以低分子化合物等作为抗原的情况下，难以制作识别不同表位的多种抗体。因此，上田等人建立了使用I种抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)、称为开放式夹心法的高精度的低分子化合物的免疫測定方法(专利文献I和2、非专利文献I和2)。该方法为如下的抗原浓度測定方法制备对抗原进行特异性识别的抗体的VH区多肽和VL区多肽，利用报告分子标记ー种多肽而制成标记化多肽，将另一种多肽固定在固相上而制成固定化多肽，使含有抗原的试样和标记化多肽与固定化多肽接触，测定结合在固定化多肽上的标记化多肽的报告分子的量。此外，作为用于測定低分子化合物的測定方法，除了免疫測定方法之外，还有液相色谱法等，但该方法需要高精度的测定仪器，并且受试体的需要量也多，测定还耗费时间，而且通用性低。此外，作为使用荧光色素标记后的抗体来測定抗原的浓度的免疫測定方法，已知如下方法利用不同的荧光色素分别对抗体和抗原进行标记，以荧光色素间发生的荧光共振能量转移(FRET)的效率的变化作为指标的免疫測定方法(非专利文献3和4);以利用通过预先在荧光标记后的抗体中混合消光物质而消光的抗体的荧光因目标检测物质的导入而增强的现象的淬灭效率的变化为指标的免疫測定方法；使用由荧光色素标记后的抗体来測定由标记抗体与测定对象物凝集而引起的荧光强度的减小的荧光免疫測定方法(专利文献3) ο现有技术文献专利文献专利文献I :日本特开平10-78436号公报专利文献2 :日本专利第3784111号公报专利文献3 日本特开平10-282098号公报非专利文献非专利文献I :上田宏，薬学雑誌，27 =71-80(2007)非专利文献2:Lim SL, et al. , Anal Chem.，79 (16) : 6193-200 (2007)非专利文献3 :Iijima I. and Hohsaka T. , Chembiochem. , 17 ; 10 (6)999-1006(2009)非专利文献4 :Kajihara D, et al. , Nat Methods. , 3 (I I) : 923 (2006)
技术实现思路
专利技术所要解决的问题如上所述，到现在为止已知的免疫測定方法均需要使抗体或抗原固相化的步骤和用于除去非特异性的标记化合物的吸附的洗涤步骤。这些步骤操作繁琐而耗费时间，而且会导致结果产生偏差，因此，要求开发不需要固相化步骤和洗涤步骤的液相体系免疫測定方法。本申请专利技术的课题在于提供ー种免疫測定方法，其不需要固相化步骤和洗涤步骤，能够在液相中快速且简易地进行目标物质的定量測定，并且能够使抗原可见化。用于解决问题的方法首先，本专利技术人使用由不同荧光色素标记的抗体VH和VL，尝试建立了以荧光共振能量转移(FRET)效率为指标的抗体/抗原结合活性评价体系。FRET測定使用由荧光色素CRllO标记的抗BGP抗体轻链区(CRllO-VL)和由荧光色素TAMRA标记的抗BGP抗体重链区(TAMRA-VH)，在不存在抗原的情况下，不发生由CRllO向TAMRA的FRET，与此相对，在存在抗原的情况下，VH和VL通过抗原而形成三者的复合物，从而预测会会发生由CRllO向TAMRA的FRET，将CRllO-VL和TAMRA-VH或未标记的VH与不同浓度的BGP抗原肽一同孵育，利用荧光强度分布分析法(FIDA)分析CRllO的荧光强度的变化。结果，在使CRllO-VL与TAMRA-VH反应的情况下，CRl 10的荧光强度依赖于BGP抗原肽的浓度而降低，因此可以确认，CRllO-VL和TAMRA-VH通过抗原肽进行结合而形成复合物，从而发生所预测的由CRllO向 TAMRA 的 FRET。另ー方面，令人意外的是，在使CRllO-VL与未标记的VH反应的情况下，CRllO的荧光强度依赖于BGP抗原肽的浓度而增加。为了确认在使用标记后的VH的情况下是否也能观察到同样的现象，本专利技术人将TAMRA-VH和CRllO-VL或未标记的VL与不同浓度的BGP抗原肽一同孵育，并对TAMRA的荧光强度的变化进行了分析。结果可知，在使TAMRA-VH与未标记的VL反应的情况下，TAMRA-VH的荧光强度也依赖于BGP抗原肽的浓度而增加。上述结果完全是预料之外的结果，从而建立了如下假说也许VL和VH作为淬灭剂对荧光色素(CRl 10、TAMRA)发挥作用，仅在VH和 VL通过抗原肽而形成复合物吋，该淬灭才会解除，从而使荧光强度增加。基于上述假说，本专利技术人尝试建立了利用淬灭现象的新的測定方法(以下有时也称为“均相突光免疫测定方法(homogenous fluorescent based immunoassay) ”)，使TAMRA-VH和不同浓度的BGP肽在存在或不存在未标记的VL的条件下反应并測定荧光强度。结果发现，在VL存在下，TAMRA-VH的荧光强度依赖于BGP肽的浓度而增加，根据存在/不存在VL时的TAMRA-VH的荧光强度之比(+VL/-VL)的分析結果，能够构建高灵敏度的均相荧光免疫測定方法。此外，本专利技术人确认，通过使用ATT0655作为荧光色素、并且借助间隔区将荧光色素标记到VH上，使上述“均相荧光免疫測定方法”的灵敏度増加。此外，本专利技术人使用将存在于VH上的4个色氨酸(以下有时也记为Trp或W)分别突变成苯丙氨酸(以下有时也记为Phe或F)而得到的突变VH进行了确认淬灭效果的实验，发现VH的氨基酸序列中的第36位、第47位、第106位(对应于Kabat编号体系中的第103位)的色氨酸作为荧光色素的淬灭剂起作用。这些色氨酸在小鼠抗体VH中高度保守，因此可知，通过应用本专利技术的“均相荧光免疫測定方法”，能够使用各种抗体进行抗原的测定。本专利技术基于以上发现而完成。专利技术效果 根据本专利技术，可以提供能够在液相中快速且简易地进行目标物质的定量測定的免疫测定方法和用于实施利用该测定方法的抗原測定的试剂盒。本专利技术的測定方法是以标记在抗体VL或VH上的荧光色素的荧光强度为指标来检测/測定抗原与上述抗体VL和VH的结合的方法，该方法基于下述新发现上述抗体VL与VH未结合吋，上述荧光色素处于淬灭的状态，当上述抗体VL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：上田宏，阿部亮二，伊原正喜，高木广明，
申请(专利权)人：株式会社蛋白质表达，
类型：发明
国别省市：