本发明专利技术公开了一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量PCR方法，荧光定量PCR方法采用一对检测细菌的通用型引物、一条适用于通用型引物的人工内参、第一条荧光标记的荧光探针和第二条荧光标记的荧光探针，两条荧光探针采用不同的荧光标记，第一条荧光探针是用于检测细菌的通用型荧光探针，第二条荧光探针是用于检测人工内参的内参探针，采用常规的PCR扩增技术进行检测。通过上述方式，本发明专利技术的检测方法，适用于血小板制品细菌污染筛查，可充分解决血小板制品细菌污染中细菌有无、细菌含量、细菌死活等问题，满足快速、准确、可靠的检测要求，为血小板安全输注提供一种科学、有效的辅助诊断方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子诊断和检测领域，特别是涉及一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量PCR方法。
技术介绍
通过输血传播的病原体主要是病毒、细菌和原虫等，我国目前纳入血源筛查的项目仅有乙肝、丙肝、艾滋病毒和梅毒螺旋体。在输血的感染性风险中，细菌污染和败血症性输血反应尚未得到足够重视。血小板制品必须在(22±2)℃条件下振荡保存，这种环境下细菌污染的概率要高于其他血液成分细菌污染或病毒感染的概率，因此血小板制品有效保存期很短，一般规定是24小时或5天。研究表明，大约每3000单位的血小板制品中就有1个单位发生细菌污染，主要污染来源是献血者皮肤菌群，献血者存在无症状的菌血症以及在制备过程中发生的污染。发生细菌污染的血小板制品如果输注到病人体内，几乎无例外都要引起轻重程度不等的输血反应，甚至是致命的菌血症和败血症。美国血库协会（AABB）2004年规定所有血小板制品在输注前均应作细菌污染检测。我国卫生部在2004年专门讨论了血液制品的细菌安全问题，但至今还没有关于血液及血液成分细菌污染检测的相关法律法规出台。开展血小板细菌污染检测，既是为了保证临床血小板输注的安全，同时也是为了充分有效利用有限的血小板资源。血小板细菌污染检测技术主要有三类：细菌培养检测、血清学免疫检测、核酸分子检测。目前以细菌培养检测方法作为金标准，其中通过FDA认证的有Bact/ALERT 细菌培养监测系统和PalleBDS细菌检测系统，均是基于细菌培养生长繁殖过程中的各种指标变化，如消耗的O2、累积的CO2、营养成分改变等，这种方法检测耗时较长，需要1～2天，会有漏检的情形发生。此外，通过FDA认证的PGD试纸条检测系统是采用细菌表面特异性抗原的单克隆抗体床旁快速检测血小板制品细菌污染，但该方法不能作为血小板质量控制检测方法，敏感性较差，对一些革兰氏阴性细菌不易检出。Scansystem系统则是利用单抗富集血小板滤过样本，对其中的细菌DNA用通透剂和荧光剂进行标记，并用激光扫描确定污染情况，该方法检测时间虽短，但灵敏度不高，最终结果判读标准复杂。目前，国内尚未开发血小板细菌制品污染相关的检测试剂及仪器。核酸检测（Nucleic Acid Test，NAT）一般是对各种病原生物的特异性靶标核酸序列进行定性、定量分析。在血液及血液制品的筛查和检测领域，核酸检测已经广泛用来检测样本是否存在病毒感染，以降低输血传播病毒性传染病的风险。如艾滋、乙肝、丙肝和梅毒（HIV，HBV，HCV，Tp）是血液相关样本法定检测的四项，目前都采用核酸检测或联合酶联免疫检测的方法进行确认。核酸检测技术平台主要是从PCR（聚合酶链式反应）、TMA（转录介导扩增）技术发展而来，其中的PCR技术应用最为广泛。荧光定量PCR是从PCR技术发展而来，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，可实时监控反应过程，通过计算机对产物进行分析，省略普通PCR的后续鉴定步骤，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。荧光定量PCR检测已经在临床疾病诊断，优生优育检测，动植物检验检疫，食品安全，科学研究等不同领域得到应用。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是提供一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量PCR方法，该方法检测快速、准确、可靠。为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是：提供一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量PCR方法，所述荧光定量PCR方法采用一对检测细菌的通用型引物、一条适用于通用型引物的人工内参、第一条荧光标记的荧光探针和第二条荧光标记的荧光探针，所述两条荧光探针采用不同的荧光标记，所述第一条荧光探针是用于检测细菌的通用型荧光探针，所述第二条荧光探针是用于检测人工内参的内参探针，采用常规的PCR扩增技术进行检测。在本专利技术一个较佳实施例中，所述一对检测细菌的通用型引物为CR5-F上游引物和CR7-R下游引物，所述CR5-F上游引物为GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGA，所述CR7-R下游引物为TTGCGICCGTAITCCCCAGGCGG，所述第一条荧光探针为CR6-probe 探针，所述CR6-probe 探针为6FAM-CAGGATTAGATACCCTG-BHQ1，扩增产物大小为202 bp。在本专利技术一个较佳实施例中，所述一对检测细菌的通用型引物为CR6-F 上游引物和CR8-R 下游引物，所述CR6-F 上游引物为TTAGATACCCTGGTAGTCCA，所述CR8-R 下游引物为GAGCTGACGACAICCITGC，所述第一条荧光探针为CR7-probe 探针，所述CR7-probe 探针为6FAM-ACTCAAAIGAATTGACGG-BHQ1，扩增产物大小为291 bp。在本专利技术一个较佳实施例中，所述一对检测细菌的通用型引物为CR7-F 上游引物和CR9-R 下游引物，所述CR7-F 上游引物为GCAACGCGAAIAACCTTACC，所述CR9-R 下游引物为TGACGTCITCCCCACCTTC，所述第一条荧光探针为CR8-probe 探针，所述CR8-probe 探针为6FAM-TGAIATGTTGGGTTAAGTCC-BHQ1，扩增产物大小为243 bp。在本专利技术一个较佳实施例中，所述一对检测细菌的通用型引物为23S3CD-F 上游引物和23S3CD-R 下游引物，所述23S3CD-F 上游引物为CTCAACGGATAAAAGITAC，所述23S3CD-R 下游引物为GACCIAACTGTCTCACGAC，所述第一条荧光探针为23S3CD -probe 探针，所述23S3CD -probe 探针为6FAM-TGTCGGCTCITCICATCCT -BHQ1，扩增产物大小为189 bp。在本专利技术一个较佳实施例中，所述人工内参采用基因合成方式制备，两端序列和所述一对检测细菌的通用型引物完全匹配，中间80bp的序列和内参探针是人工设计的，与任何细菌及人类基因组没有任何相关性，所述人工内参的结构为5’上游引物序列-人工序列-下游引物互补序列 3’。在本专利技术一个较佳实施例中，所述人工内参加入到检测样本中，可设为最低检出限或任意阈值，也可作为标准品，具有对检测结果提供质控、判读、定量参照功能。在本专利技术一个较佳实施例中，所述荧光定量PCR方法中通过反转录荧光定量PCR检测样本中的RNA，与人工内参和相应DNA的Ct值进行比较，判断细菌是否为活性菌。本专利技术的有益效果是：本专利技术的通用型检测血小板细菌污染的荧光定量PCR方法，该方法只用一对引物，两种探针就能完成血小板细菌污染的检测，其人工内参除了具有一般内参功能外，还可作为标准品使用，解决了目前血小板制品细菌污染缺少标准品的问题，也使得核酸检测用于血小板制品细菌污染筛查成为可能。本专利技术对常规荧光定量PCR方法进行了重新设计和优化，使其更适用于血小板制品细菌污染筛查，可充分解决血小板制品细菌污染中细菌有无、细菌含量、细菌死活等问题，以及满足快速、准确、可靠的检测要求，为血小板安全输注提供一种科学、有效的辅助诊断方法。...
【技术保护点】
一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述荧光定量PCR方法采用一对检测细菌的通用型引物、一条适用于通用型引物的人工内参、第一条荧光标记的荧光探针和第二条荧光标记的荧光探针，所述两条荧光探针采用不同的荧光标记，所述第一条荧光探针是用于检测细菌的通用型荧光探针，所述第二条荧光探针是用于检测人工内参的内参探针，采用常规的PCR扩增技术进行检测。
【技术特征摘要】
1.一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述荧光定量PCR方法采用一对检测细菌的通用型引物、一条适用于通用型引物的人工内参、第一条荧光标记的荧光探针和第二条荧光标记的荧光探针，所述两条荧光探针采用不同的荧光标记，所述第一条荧光探针是用于检测细菌的通用型荧光探针，所述第二条荧光探针是用于检测人工内参的内参探针，采用常规的PCR扩增技术进行检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述一对检测细菌的通用型引物为CR5-F上游引物和CR7-R下游引物，所述CR5-F上游引物为GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGA，所述CR7-R下游引物为TTGCGICCGTAITCCCCAGGCGG，所述第一条荧光探针为CR6-probe 探针，所述CR6-probe 探针为6FAM-CAGGATTAGATACCCTG-BHQ1，扩增产物大小为202 bp。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述一对检测细菌的通用型引物为CR6-F 上游引物和CR8-R 下游引物，所述CR6-F 上游引物为TTAGATACCCTGGTAGTCCA，所述CR8-R 下游引物为GAGCTGACGACAICCITGC，所述第一条荧光探针为CR7-probe 探针，所述CR7-probe 探针为6FAM-ACTCAAAIGAATTGACGG-BHQ1，扩增产物大小为291 bp。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述一对检测细菌的通用型引物为CR7-F 上游引物和CR9-R 下游引物，所述CR7-F 上游引物为GCAA...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒙青林，李勇，田晶晶，魏双施，王红梅，段生宝，丁少华，陈晔洲，李冬，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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