一种载GDNF微泡制剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种载GDNF微泡及制备方法。该载GDNF微泡由内部包裹生物惰性气体的脂质双分子层和连接于所述脂质双分子层外侧的生物素化的GDNF组成。采用MRI实时引导低频聚焦超声联合载有GDNF微泡开放BBB辐照大鼠颅脑顶叶皮层区(最佳参数设定为探头频率1MHz，微泡量0.5ml，照射时间60s，声压0.8MPa，延时60s)，可促进GDNF透过血脑屏障，增加中枢神经系统内GDNF的有效药物浓度。通过低频聚焦超声联合靶向微泡技术，进行有效大分子突破BBB后的药理学研究，将进一步增加神经营养因子在治疗脑疾病方面的优势，提供GDNF治疗中枢神经疾病的科学依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及ー种载⑶NF微泡制剂及其制备方法。
技术介绍
胶质细胞源性神经营养因子(glialcell line derived neurotrophic factor,GDNF)是神经营养因子家族中最具代表性的成员之一，最初在大鼠的B49神经胶质细胞株中被发现，是分子量为24kDa的大分子蛋白。GDNF广泛存在于发育的中枢神经系统以及成熟的脑组织，高水平表达于在纹状体、丘脑、皮质及海马，对多种神经元如神经胶质细胞、5_羟色胺能神经元和多巴胺能神经元都具有促进生长、保护和修复功能，而且也可以调节去甲肾上腺素能和Y-氨基丁酸能途径。⑶NF对于帕金森病及阿尔茨海默病等神经变性疾病的作用已经得到了公认，近期的临床及动物实验表明GDNF在抗抑郁症治疗中起着重要作用。研究还发现GDNF与多种中枢神经系统疾病相关，如抑郁症、药物依赖、阿尔兹海默病坐寸ο然而，由于⑶NF分子量较大(24kDa),难以透过血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)，其治疗效果受到了严重限制。因此，如何促进⑶NF透过BBB、增加⑶NF在中枢神系统内的有效药物浓度，将是应用GDNF治疗中枢神经系统疾病的一个关键科学问题。BBB是指脑毛细血管阻止某些物质(多是有害的)进入脑循环血的结构，这种结构可使脑组织少受甚至不受循环血液中有害物质的损害，从而保持脑组织内环境的基本稳定，对维持中枢神经系统正常生理状态起着重要作用。近年研究结果提示，血脑屏障是ー个复杂的细胞系统，其主要由内皮细胞、内皮细胞的紧密连接、星形细胞、周皮细胞和血管周围的小胶质细胞以及基膜等结构构成并维持了血脑屏障的特殊功能，保持了中枢神经系统内环境的稳定。BBB在有效阻挡血液中有害物质对脑的侵袭、保障其功能正常发挥的同吋，也阻挡了 98%以上小分子药物和100%的大分子药物，研究表明，只有高脂溶性的、低分子量(200-400Da)的小分子量物质才能通过BBB，这种限制阻挡了绝大多数治疗性药物的进入，使得脑恶性肿瘤、帕金森氏病、阿尔兹海默病、多发性硬化、中风、创伤性脑损伤等许多中枢神经系统疾病难以药物治疗，因此如何治疗性地开放BBB，是近年来研究的热点。开放血脑屏障的传统方法较多，但均未能取得满意效果。如通过动脉内注入高渗溶液(如甘露醇)引起内皮细胞皱缩，导致广泛血脑屏障数小时的紧密连接开放；溶剂如高剂量的酒精或者ニ甲基亚砜(DMSO)烷基化物如左旋苯丙氨酸氮芥、免疫辅助剂和细胞活素也被用于开放BBB。滲透和化学方法都要求施行导管插管术，这种直接注射是侵入性的并且需要开放颅骨，容易引起非靶区脑组织的滲透性増加，甚至可能引起脑组织破坏、出血、感染；并且高渗溶液及化学试剂容易弥散，造成所注入动脉及分支所支配的BBB全部开放，因而缺乏选择性，限制了其在临床的应用。大量研究显示,超声波能在一定条件下开放血组织屏障。Taniyama等在离体试验中成功实现DNA质粒转染入鼠颈动脉组织，体外证实了超声辐照能増加生物膜的通透性。随后Mesiwala等于2002年选用高功率聚焦超声研究证实，在一定超声強度下选择性开放BBB，并不引专利技术显的脑组织损伤。为降低超声能量，研究者发现用聚焦超声协同外源性的空化核(微泡)实现了在未引发急性神经元损伤的情况下短暂开放免BBB，进而认为聚焦超声能实现高选择性、非侵入性地开放BBB ;而在微泡存在的情况下，开放BBB所需的超声能量明显降低，这有利于实现用更低能量的超声达到选择性开放BBB而不损伤正常脑组织的目的。基于聚焦超声联合微泡有效无创地开放BBB，有学者在此基础上注入微泡optison后，用低频超声多点照射开窗的脑组织，采用多种手段(光镜、电镜及MRI)，均观察到BBB的开放。实验证实超声联合微泡能局部、可逆和无创的开放BBB，为临床应用有效治疗颅内疾病的药物提供了非常积极的应用价值。在进行超声联合微泡开放BBB的可行性研究的同时，研究者并没有忽视安全性的评价。不同的研究小组都证实超声协同微泡开放血脑屏障存在安全域值，只是由于不同研究者使用的超声參数、辐照时间、微泡浓度、观察方法等不尽相同，因而得出的结论不尽一致。研究者发现采用发射频率I. 5MHz、脉冲重复频率1Hz、瞬时峰值声压幅度2 12. 7MPa超声辐照兔脑20s，MRI增强显像及组织学检查发现，当声压达6. 3MPa时出现脑组织的损伤，表现为血管壁破坏、出血、偶见坏死。另ー研究小组采用发射频率I. 63MHz、脉冲重复频率1Hz、声压幅度O. 7 I. OMPa的脉冲超声辐照兔脑20s，辐照后对整个脑组织进行组织病 理学观察，发现在超声照射区仅见少数细胞凋亡；而且在超声辐照4周后无论进行增强MRI检查还是组织病理学检查都没有发现BBB损伤。以上多项研究中的结论均一致表明，现代影像学技术可以实时显示正常的BBB的完整性和被疾病损害的区域性BBB。同时，多种方法打开BBB的影像学研究未观测到脑组织受损。随着聚焦超声联合微泡造影开放BBB研究的深入，有不少学者利用超声开放BBB，采取靶向释放的方式，治疗中枢神经系统的疾病。研究者用聚焦超声开放血脑屏障转运靶向多巴胺受体的抗体进入脑组织，结果显示在超声开放BBB后，所转运入脑的抗体能识别脑细胞膜上的多巴胺受体。总之，超声载药微泡的深入研究应用超声联合微泡开放BBB的同时，微泡携带药物或基因可靶向治疗颅内疾病，为颅内疾病的治疗提供了新的策略。但目前，关于核磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)引导聚焦超声联合载药微泡开放BBB，传递GDNF治疗各种中枢神经系统疾病的研究尚未报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供ー种载⑶NF微泡及其制备方法。本专利技术所提供的载⑶NF微泡，由内部包裹生物惰性气体的脂质双分子层和连接于所述脂质双分子层外侧的生物素化的GDNF组成。其中，所述脂质双分子层具体可由下述质量份的物质组成ニ硬脂酰磷脂酸胆碱4. 9-5. I份、ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇2000 O. 9-1. 2份、ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇2000-生物素O. 9-1. 2份；所述脂质双分子层与生物素化的⑶NF通过生物素-抗生物素蛋白-生物素连接。所述载⑶NF微泡的平均粒径为2-3 μ m。所述载⑶NF微泡的载药量为46. 54% -46. 62%。所述生物惰性气体可为六氟化硫或者全氟丙烷。制备所述载⑶NF微泡的方法，包括下述步骤I)将ニ硬脂酰磷脂酸胆碱4. 9-5. I份、ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇20000. 9-1. 2份、ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇2000-生物素O. 9-1. 2份溶解于三氯甲烷中混匀，在干燥的N2流作用下除去三氯甲烷，使磷脂在容器壁上形成一层均匀的薄膜，真空干燥2小时以上；2)在含有干燥磷脂薄膜的容器中加入脱气的pH值为7. 4的Tris缓冲溶液，得到磷脂溶液，其中，所述Tris缓冲溶液中含体积分数为10%的甘油和体积分数为10%的丙ニ醇； 3)加热所述磷脂溶液到其相转变温度以上，并用水浴超声使磷脂溶液彻底分散直至透明，然后分装入西林瓶中，并将瓶中的空气置换成生物惰性气体，震荡，得到微泡；4)离心漂浮法清洗微泡3-4次，除去未形成微泡的磷脂；在清洗后的微泡中加入抗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈芸，王峰，石宇，陆林，孙成玉，刘俐，郑海荣，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：