本发明专利技术涉及一种miRNA检测探针和可视化检测miRNA的方法。本发明专利技术的miRNA检测探针包括三个部分：靠近3'端为G-四链体形成序列，中间是待测靶标miRNA互补序列，5'端为干扰序列。探针在通常条件下为hairpin结构，加入靶标后，由于DNA-RNA杂合体的碱基对数与稳定性均高于干扰序列形成的DNA双链，hairpin结构将打开。打开的hairpin结构在双链特异内切酶的作用下可释放出G-四链体形成序列，再在钠钾离子作用下使之形成G-四链体，与Hemin组装从而产生有过氧化物酶活性的催化剂。本发明专利技术检测miRNA的方法只需一条探针，产生的信号可视化，而且不需昂贵仪器。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学和核酸化学领域，涉及。
技术介绍
MicroRNAs (miRNAs)是真核细胞中 发现的一类有调控功能的非编码RNA，通常大约有20 25个核苷酸。miRNAs是由较长的含有hairpin结构的前体经过Dicer酶的剪切加工形成的，随后与RNA诱导的沉默复合体(miRISCs)结合，并通过碱基互补配对识别相应的信使RNA(mRNA)。由于互补程度的不同,miRNA可以降解或阻遏祀mRNA阻遏祀mRNA的翻译。miRNA在动植物中有广泛表达，参与细胞增殖凋亡、发育、病毒防御、造血、器官形成、月旨肪代谢等多种调节过程。miRNA具有保守性，特异性和时序性，只在特定的细胞和组织中表达，因此决定了细胞和组织功能的特异性。区别于寡核苷酸和RNA的降解片段，miRNA3’端为羟基，5’端有一个磷酸基。目前，miRNA的功能仅被部分阐明，近年来，有报道miRNA与细胞癌变具有密切关联。miRNA的功能类似于癌基因或抑癌基因，有些miRNA会协同行使癌基因的功能，使一些凋亡蛋白受到抑制而另外一些miRNA在正常组织中高表达，它们的缺失或低表达可以导致细胞的转化和一些癌基因的激活。因此，miRNA可以作为一个重要的肿瘤标识物，针对miRNA的检测对于早期诊断和愈后诊断有重要意义，同时也为其功能研究提供重要依据。miRNA由于同源性高，长度较短，细胞或组织内含量低，针对它的高灵敏高选择性检测方法仍然有待进一步完善。目前的miRNA检测方法仍然以传统的Northern Blot为主，依赖于转印迹与杂交。这种方法主要的缺点在于工作流程长，操作复杂，费时，同时需要的样本量大，灵敏度有限，而且探针需要放射性或碱性磷酸酶等标记，这些都产生环境污染与资源浪费。近年发展了一些新的检测方法。芯片技术的发展为高通量检测及筛选带来重大突破，芯片的应用结合不同标记包括碱性磷酸酶，荧光标记，量子点纳米金等，提供了多种信号放大的途径，大大提高了检测的灵敏度。但是芯片及各种标记法均带来检测成本的提高。随后，分子信标的应用为miRNA的检测带来了新的途径，但是在检测miRNA的应用中由于miRNA长度的限制，使得分子信标环状区的长度局限于20-25个碱基左右，因而往往无法完全打开茎杆区而仅产生较低信号，同时分子信标荧光的产生只能是线性扩增，放大倍数不高。随后，RT-PCR的应用，滚环扩增，恒温指数扩增等均发展用来检测miRNA，这些方法各有优势，但是复杂的标记及探针设计，仪器的要求等仍然限制着它们的应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种miRNA检测探针和高灵敏低成本检测miRNA的方法。本专利技术是基于G-四链体与血红素Hemin形成的复合物具有过氧化物酶活性，催化底物2，2'联氮双(3'-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)被过氧化氢氧化，产生绿色产物。本专利技术的探针在靶标miRNA存在的条件下被双链特异性内切酶的酶切后释放出G-四链体形成序列，在钠钾离子及Hemin的共同作用下形成有过氧化物酶活性的复合物，对过氧化氢催化底物ABTS反应，产生绿色产物。此过程可肉眼观察，从而实现miRNA的可视化检测。工作原理如图I所示。为实现上述目的，本专利技术所提供的检测探针如下一种miRNA检测探针，包括三个部分靠近3'端为G-四链体形成序列，中间是待测靶标互补序列，5'端为干扰序列；所述G-四链体形成序列含有4段GGG序列参与G-四链体形成；所述待测靶标互补序列为loop环，与相应的靶miRNA完全互补；所述干扰序列有5-10个与G-四链体形成序列互补的碱基。所述G-四链体形成序列在非工作条件下，与干扰序列互补配对而不形成G4，整个探针为hairpin结构。仅当有待测祀标存在时,hairpin结构打开,在双链特异内切酶的作用下，G4序列被释放出来形成四链体结构，产生过氧化物酶活性。在没有靶标miRNA的情况下，由于干扰序列形成双链区具备一定的稳定性，hairpin结构仍然保持。加入靶标后，由于DNA-RNA杂合体的碱基对数与稳定性均高于干扰序列形成的DNA双链，hairpin结构将打开。我们引入一种双链特异的内切酶，只对双链DNA及DNA-RNA杂合体中的DNA链切割，而对于单链DNA及RNA不切割。打开的hairpin结构在这种酶切的作用下可释放出G-四链体形成序列，再在钠钾离子作用下使之形成G-四链体，从而产生有过氧化物酶活性的催化剂。为减少探针自身在钠钾离子条件下形成G-四链体或干扰序列在酶作用下被切割而释放出G-四链体导致的背景升高，我们对干扰序列的长度进行了优化。优化结果显示，当干扰序列的长度为8个碱基时，其检测的效果是最佳的，阳性信号和阴性信号的差别最大，可以达到16。为方便使用，本专利技术还提供包括含有上述miRNA检测探针的试剂盒。本专利技术还提供一种可视化检测miRNA的方法，其包括如下步骤I)、设计DNA过氧化物酶检测探针体系根据待测miRNA设计合成本专利技术所述的miRNA检测探针；2)、将合成的miRNA检测探针与待测miRNA互补配对，并加入双链特异内切酶，通过酶切释放出G-四链体；3)、加入钠钾离子，并与Hemin共同培育，然后通过过氧化物酶所催化的显色反应，来检测相应靶miRNA。当待测miRNA为miR141时，上述检测方法的优选的条件是miRNA检测探针干扰序列的长度设置为8个碱基，miRNA检测探针的浓度为IOOOnM,双链特异性核酸内切酶的用量为0. IU。本专利技术的优点和有益效果在于I、本专利技术的检测miRNA的方法中，设计的每一个探针针对一个特定的miRNA序列；只需单一探针，不需要额外模板序列，组装探针或是竞争序列；信号强度与背景可相差16倍，探针对靶标的特异性识别，在其他不与之完全配对的miRNA存在的情况下不产生明显增强信号；所有结果均仅用肉眼观察即可明确地区分靶标miRNA。2、本专利技术的miRNA检测探针可满足不同检测需要。探针可用于快速筛查样本中是否含有靶标miRNA ;对于已知存在靶标miRNA的，通过本探针与标准品作工作曲线从而计算出实际样品的靶标含量。3、本专利技术设计的探针对实际临床样本中的靶标有较好响应，且对于不同表达量的样品有较好区分度。附图说明图1本专利技术的可视化检测miRNA方法的工作原理图。图2实施例I所检测的miRNA序列。图350nM MiR141存在条件下系列优化探针干扰片段长度的响应。图4不同浓度双链特异内切酶和DNA探针条件下的响应图5探针浓度I μ M，DSN浓度为O. IU时，miR141的浓度梯度。图6不同浓度miR141体系产生的最大紫外吸收信号。图7特异设计针对miR141的探针分别对miR141及miR429的响应。图8从MCF-7及HeLa细胞提取的miRNA样本中，利用本专利技术设计的探针检测miR141的响应。具体实施例方式以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制。若无特别说明，本专利技术中所涉及到的实验均为本领域技术人员所熟知的常规操作。实施例11. miRNA检测探针体系的设计(1)探针包含三个部分，G-四链体序列，该G-四链体即为通常意义上的信号部分；干扰序列；与靶标互补序列，这部分序列设计为特异检测目标miR本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周翔，王少儒，田沺，翁小成，肖珩，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：
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