本发明专利技术公开了一种基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法，包括采用多基因多区域两步单向扩增捕获特异核酸靶标方法进行制备单链DNA文库后，采用高通量测序技术对获得的单链DNA文库进行测序，然后对测序结果进行核酸的定性分析和定量分析，获得核酸定性定量检测结果。该方法比普通的real-timeQ-PCR定量方法成本低很多，应用更加广泛提高了核酸定量的样本通量，可以对核酸的系列进行精确的定性和定量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因测序
，具体涉及ー种。
技术介绍
高通量测序技术是对传统测序(Sanger测序)一次革命性的改变。传统测序技术一次只能测单ー的基因片段，在1990年-2003年首次完成的ー个人的全基+因组测序使用的就是传统的Sanger法，花费了十几年的时间，耗费了巨大的资金，动员了多个国家的数百科学家。而高通量测序可一次对几十万到几百万条甚至几千万条DNA分子片段进行序列測定，完成ー个人的基因组测序目前达到只需要几天的时间，成本降到几千美元。高通量测序一般称为下一代测序技木。高通量测序技术包括目前的Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和HiSeq技术、ABI公司的SOLiD技术、Life technologies 公司的 Ion torrent 测序技术、Helicos HeliscopeTM 和 PacificBiosciences推出的单分子测序技术，及将要出现的其它高通量测序技木。高通量测序技术应用前景很广，已经应用到各物种基因组全测序、表观基因组学、宏基因组学及功能基因组学研究的许多方面。虽然这些应用极大地増加了发现与人类疾病息息相关的各种基因突变、短片段插入/缺失、基因组水平异常的机会，但目前还主要停留在研究阶段，还没有作为临床诊断和检测手段，更没有对各种环境下的微生物种群及其比例关系进行鉴定。造成这种现状的主要原因一是现有高通量技术使用成本高，ニ是还没有一种基于高通量测序的定性定量方法。目前常用的核酸定性方法是做ー个PCR扩增，有产物产生就断定是某种DNA。这种方法虽然简单，但一次只能鉴定ー种DNA;又由于PCR非常灵敏，极易被污染造成假阳性結果。研究核酸定量的方法目前是real-time Q-PCR(荧光实时定量PCR)方法。所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团或者荧光探针，利用荧光信号产生时的扩增循环位点(Ct值)与样品中靶标的量有对数关系，实时监测整个PCR进程中荧光信号的累积过程，最后通过与样品中另ー參照物或标准曲线进行比对的定量分析方法。因此，靶标定量有两种策略相对定量和绝对定量。相对定量指的是在样本中靶标量相对于另ー參照物的量。绝对定量指的是用已知量的标准曲线来推算靶标的未知量。在ー份核酸混合物样品中利用real-time Q-PCR技术定量分析各成分，除每次主要只能分析ー个成分外，无论是相对定量还是标准曲线定量方法仍存在ー些PCR定量方法均有的问题有待解決。在标准曲线定量中，标准品的制备是ー个必不可少的过程。目前由于无统ー标准，各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性。此外，用real-time Q-PCR来研究mRNA时，受到不同RNA样本存在不同的逆转录(RT)效率的限制。在相对定量中，其前提是假设内源控制物(參照物)不受实验条件的影响，合理地选择合适的不受实验条件影响的内源控制物也是实验结果可靠与否的关键，实验证明要做到这一点是很难的。另外，与传统的PCR技术相比，Real-time Q-PCR的不足之处是(I)由于运用了封闭的检测，減少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小；(2)因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制了 real-time Q-PCR的复合式(multiplex)检测的应用能力；(3)目前real-time Q-PCR实验成本比较高,技术操作难度大，从而也限制了其广泛的应用。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种，解决了现有技术中荧光实时定量PCR方法进行核酸定性和定量检测中的种种不足之处。为了解决现有技术中的这些问题，本专利技术提供的技术方案是一种，其特征在于所述方法包括以下步骤(I)将待捕获的基因组随机打断后采用第一引物进行第一次PCR扩增；所述第一引物一端与标记有生物素的第一接头DNA片段相连，并与待捕获的目的基因区域序列互补结合的寡核苷酸单链序列；(2)使用捕获组分对进行第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列进行捕获；所述捕获组分包括亲和素和与亲和素结合的固相载体；所述亲和素与所述第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列上的生物素相结合；(3)使用第二引物对亲和素结合后的目的基因区域序列进行第二次单向PCR扩增；所述第二引物一端与第二接头DNA片段相连，并与所述目的基因区域序列互补结合，且与第一引物进行PCR扩增的方向相反；(4)将第二次单向PCR扩增后的目的基因区域序列除去亲和素生物素复合物，获得两端带有相同或不同DNA接头的单链DNA文库；(5)采用高通量测序技术对获得的单链DNA文库进行测序，然后对测序结果进行核酸的定性分析和定量分析，获得核酸定性定量检测結果。优选的，所述方法中固相载体为微球。优选的,所述方法中固相载体为磁性微球。优选的，所述方法中所述亲和素选自卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素。优选的，所述方法中所述第一接头DNA片段具有SEQ No 1的连续核苷酸序列，且5’端通过生物素进行标记；第ニ接头DNA片段具有SEQ No 2的连续核苷酸序列。优选的，所述方法中所述第一引物由第一接头DNA片段、ACTG碱基组和用于特异性扩增目的基因靶向序列，含有目的基因的至少15个连续的核苷酸序列的特异性引物连接而成；所述第二引物由第二接头DNA片段、ACTG碱基组和用于特异性扩增目的基因靶向序列，含有目的基因的至少15个连续的核苷酸序列的特异性引物连接而成。优选的，所述方法中所述第一引物进行第一次PCR扩增的第一 PCR反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2, TaqDNA聚合酶、待捕获的目的基因区域序列作为模板DNA，所述第一 PCR反应体系终浓度组成为PCR缓冲液终浓度I IOX ; dNTPsO. 01 I. 5mM ；引物序列终浓度为O. 01 2 μ M ;模板DNAO. 01 IOng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶 O. 01 I. OU/ μ L ;MgCl2终浓度为 O. 5 5mM。优选的，所述方法中所述第二引物进行第二次PCR扩增的第二 PCR反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2, TaqDNA聚合酶、待捕获的目的基因区域序列作为模板DNA，所述第二 PCR反应体系终浓度组成为PCR缓冲液终浓度I IOX ; dNTPsO. 01 I. 5mM ；引物序列终浓度为O. 01 2 μ M ;模板DNAO. 01 IOng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶 O. 01 I. OU/ μ L ;MgCl2终浓度为 O. 5 5mM。优选的，所述方法步骤(I)中待捕获的基因组是从选自人或动物或微生物群体中提取的。优选的，所述方法步骤(5)中高通量测序技术选自454焦磷酸测序方法、IlluminaSolexa合成测序方法、ABI SOLiD连接法测序方法、Life technologies公司的Ion torrent测序方法、单分子测序方法。优选的，所述方法步骤(5)中进行核酸的定性分析和定量分析是利用计算机软件计数和简单的统计分析(t-test)、标准差分析方法来完成。本专利技术待捕获的基因组样本来自包括但不限于人或动物血液组织、其他组织和排泄本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨楠，艾洪新，臧伯玮，何越，
申请(专利权)人：凯晶生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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