微腔室静态PCR与毛细管电泳CE功能集成微流控芯片制造技术

本发明专利技术涉及微腔室静态PCR与毛细管电泳CE功能集成微流控芯片，上盖片的下表面设有PCR反应腔、样品池、缓冲液池、样品废液池、废液池、十字型沟道，PCR反应腔体积小于1μl；下基片的上表面设有与上盖片上的PCR反应腔的位置相对的加热电极和温度传感电极，以及分别与样品池电极点、缓冲液池电极点、样品废液池电极点、废液池电极点直接电性连接的高压电极；下基片的上表面覆键合中间层，上盖片键合于下基片上，在上盖片上设有放样孔，与放样孔相对的键合中间层上也分别设有通孔，放样孔经通孔与其对应的池相贯通。该芯片具有实时和终点检测一个或多个PCR片段功能，具有检测五色荧光的特性，即使片段的大小相等也可进行分辨。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种微腔室静态PCR与毛细管电泳CE功能集成微流控芯片，属于PCR与CE集成

技术介绍
微流控芯片(Microfludics)指的是在一块几平方厘米的芯片上构建的化学或生物实验室，可以在微观通道下依靠电、磁、机械、化学等各种方式进行实验操作，以实现其设计的功能。目标是将化学和生物领域涉及的样品制备、反应、分离、检测、培育、分选等集成在微芯片上，而且可多次使用，最终发展方向是微全分析系统。微流控芯片其最大的特点是生化环境依赖于MEMS微细加工制作出来的微流体环境，以可靠微流体贯穿整个系统，这也是其中文译名的由来。微流控芯片的构造一般为多层结构的复合封装，最简单的微流控芯片就是使用一片基材用微加工技术刻有细微通道，然后与另外一块平整基材覆合在一起，·形成具有封闭通道的芯片，在其中一片上还有通道的进出口，以进行芯片内外的流体交换。微流控芯片在应用上具有以下突出特点 1)流体处于微米级甚至纳米级的微通道环境中，因此流体基本都呈现出低雷诺数和层流流动的特点，使得其流动状况与混合情况都与宏观尺度表现出不一样的情况。通过合理的流体通道设计，流体的混合、分流、改变流向的复杂的过程将短时间内完成，同时MEMS技术的加工可以使得微流控通道能够通过电、磁、机械等各种方式对流体以及流体内部介质进行控制，使得微流控芯片具有极高的可操作性； 2)微流控芯片中尺度为微观，流体与颗粒都具有高的体表面积比，能够提高生物化学反应的速度，因此微通道中的反应需要的剂量小但呈现高通量、反应时间很短，往往为秒甚至毫秒级，使得微流控芯片具有高效的特点； 3)芯片的微环境的热容量小，可进行高速的升降温控制，并能精确的检测与控制不同区域的温度；在微流控通道中更容易实现宏观尺度下难以实现的温度快速精确变化，高精度的温控对研究特殊的生化反应有着突出贡献； 4)微流控芯片可采用多种检测手段对微流控通道中的试剂进行直接检测，包括激光诱导突光检测(Laser induced fluorescence, LIF)、实时突光检测、电化学检测、质谱检测等方式等。因此微流控芯片中进行生化反应的结果可以在线获得，并转化为电信号直接输出到计算机中进行处理，大大降低了实验的复杂性，提高了对实验结果的精度与可调试性； 5)高度整合度，通过合理的芯片设计将使得不同的复杂的反应过程能够集成于同一个反应芯片上，实现功能一体化自动化，防止了转移时试剂的浪费和污染；同时由于MEMS加工技术的特点，这种高度整合的微流控芯片还能批量化低成本的生产，有利于这种具有复杂功能集成的微系统在各个领域的发展。聚合酶链式反应(PCR)是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制，PCR技术原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成①模板DNA的变性模板DNA经加热至94°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便与引物结合，为后续反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50-65 °C，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。PCR技术已经是生命科学和医学领域发展中一个重要发展方向，成为一种广泛应用的检测手段与技术方法，在生命科学、医学工程、遗传科学、法医鉴定等方面都具有广阔的应用价值。PCR扩增的关键是快速而准确的控制温度循环，PCR扩增循环中的每一步都有最短的有效反应时间，温度变化过程太长不仅浪费时间，且随着时间的延长Taq DNA聚合酶的活性而逐渐下降，因此较长的反应过程对PCR是很不利的。因此直接提供PCR反应效率的思路就是减少PCR混合液的体积，可以缩短循环时间，提高扩增产物的含量。 这恰恰是以微米为尺度的微流控芯片的突出特点。因此利用MEMS加工技术制作出高效的PCR微流控芯片成为微流控芯片发展的一个重要分支。PCR微流控芯片是PCR技术和MEMS技术在新技术环境下的高效结合。随着微流控芯片技术发展，以MEMS加工工艺在硅、玻璃和聚合物材料基础上加工出来的PCR微流控芯片，内部集成了微阀、微泵等流体控制元件和微加热器、微传感器等温度控制元件，在微米量级甚至更低的封闭环境中完成了样品的操作与PCR反应，而后续集成的检测部件中还能完成扩增结果的分离和检测。因此使得PCR反应获得了更大的集成度和极高的反应效率。PCR微流控芯片具有以下明显优势 1)温度循环系统体积减小，热容降低，可以达到很高的升/降温速率(甚至可高达60-900C / S)，反应时间成倍缩短； 2)反应液体积减小，反应试剂的消耗量降低，反应液温度的均匀性提高，扩增的特异性增强，既节省了成本又提高了效率； 3)微通道的比表面积较大，可选用导热系数高的材料，提升热传递速率，大大降低反应液温度平衡的时间和循环所需要耗费时间，温度能够更快的稳定和检测； 4)芯片易于集成和功能化，能够快速便捷的实现扩增、结果分析一体化，空间尺度的减小使得可以利用微加工技术将微加热器和温度传感器等直接集成在芯片上，可进一步提高热传递速率；也可将芯片与样品纯化、混合、芯片电泳和荧光实时检测等操作过程集成，提高自动化程度和一体化过程。PCR微流控芯片在发展中主要可以分为静态微腔室式PCR和连续流PCR两大类，两者的主要差别在于进行PCR循环时反应液是否处于流动状态，若是处于静止状态一般可归于静态腔室型，若处于不断的流动状态则一般可以归于连续流型。传统的静态微腔室型PCR芯片结构比较简单，一般使用微加工技术加工出反应的微腔室(微腔室有可以封闭的流体进出口)，用于加热与温度传感的电极以及冷却与散热装置。其基本原理和传统PCR仪器相近，是对注入反应腔内的PCR反应混合物进行直接的升降温控制，实现温度循环。虽然结构简单，但是由于微观尺度效应，热惯性小，PCR反应液在微腔室中可以很快地进行升降温工作，热传感器也能及时反馈并对温度进行控制。由于微腔室芯片结构简单，也意味着能够在一块晶片上加工多个反应池，同时进行多个PCR反应。通过微加工制作的微腔室也可以通过微通道和流体控制与其他功能部件相连，实现功能集成化，这些特点都在实际使用中具有很大的优势。静态微腔室型PCR芯片显著地降低了混合液的消耗量，但温控系统及结构设计直接决定的加热冷却速度仍旧对温度循环与稳定起着决定性影响，一般来说与理想的升降温反应速度仍旧有一定差距。一般加热与散热装置需要集成加工在芯片上，这使得加工成本也有所上升。且传统静态腔室PCR芯片的试剂准备、反应后试剂提取依旧需要有外部转移过程，可能导致试剂的浪费与转移污染的出现。因此，向着实现类似连续流PCR的独立多温区循环与更多的功能集成化发展都成为静态腔PCR芯片发展的方向。毛细管电泳(Capillary Electrophor本文档来自技高网...

【技术保护点】
微腔室静态PCR与毛细管电泳CE功能集成微流控芯片，其特征在于：包括上盖片、与其相键合的下基片以及键合中间层，所述上盖片的下表面设有PCR反应腔、样品池、缓冲液池、样品废液池、废液池、PCR反应腔与样品池之间的沟道以及样品池、缓冲液池、样品废液池、废液池之间的十字型沟道，PCR反应腔的每一端均设有毛细管阀，PCR反应腔的前端设有进样孔，？PCR反应腔的体积小于1μl；所述下基片的上表面设有与上盖片上的PCR反应腔的位置相对的加热电极和温度传感电极，以及分别与样品池、缓冲液池、样品废液池、废液池的位置相对的电极点，以及分别与样品池电极点、缓冲液池电极点、样品废液池电极点、废液池电极点直接电性连接的高压电极；所述下基片的上表面覆键合中间层，上盖片键合于下基片上，在上盖片上与样品池、缓冲液池、样品废液池、废液池的位置相对的部位分别设有放样孔，与所述放样孔相对的键合中间层上也分别设有通孔，放样孔经通孔与其对应的池相贯通。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何越，唐伟忠，李民，艾洪新，杨楠，
申请(专利权)人：凯晶生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：