本发明专利技术公开了一种二步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法。该方法是将生物基质样本(如尿液、血液、脑脊液)及组织液等经过一系列超声、离心、肟化，除脲素、除磷、除硫、除蛋白、氮吹、真空干燥及三甲基硅烷化衍生等理化方法技术处理后，再采用气相色谱仪-质谱联合技术对生物基质样本进行检测。该方法能同时对生物基质样本进行程序化处理，一次性检测五大类以上物质400余种代谢中间和终末产物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物基样品的二步衍生法同步分析方法领域，具体涉及采用试管或滤纸片作为标本载体的二步衍生法同步分析生物基样品中碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法。
技术介绍
人体尿液中含有碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类等许多内源性化合物的终末或中间代谢产物，这些有机化合物有相对较高的水溶性和肾廓清率，其浓度通常亦高于血清和其他组织体液，如尿液、血液、CSF(脑脊液)及组织液等，其中尿标本最易于收集，为非侵入性操作性技术，为国内外研究者所认同。二十世纪我国对遗传代谢性、营养性等代谢性疾病仅能进行初步检测，依赖欧日美等发达国家的检测技术且需将标本送至国外合作单位方可确诊；近十年来我国引进气相色谱-质谱联用(gas chromatography massspectrometry, GC-MS)尿有机酸检测方法仅仅是检测有机酸类遗传代谢性疾病,而缺乏碱基、核苷、氨基酸及糖类等遗传代谢性疾病的筛查、监测和研究的样本预处理及同步分析方法，因而也严重影响我国各类代谢性疾病医学领域的整体研究水平。首先，无论是色谱柱离子交换法还是有机酸萃取法，都只能分析尿中有机酸类物质且数量少，鲜有超过200种物质的文献报道；采用的是通过化学方法富集尿中有机酸，从而达到检测尿中有机酸的目的；现有的传统分析方法，无论是分析样本中酸性、碱性及中性有机酸类物质的数量，还是分析样本中物质的种类，和样本中客观存在的实际小分子的数量和种类相比，都存在严重不足，更缺乏碱基、核苷、氨基酸及糖类等物质的提取和同步分析的方法。其次，虽然脲素酶预处理法不经有机酸萃取直接进行GC-MS分析，用以鉴定有机酸和部分氨基酸及部分糖类代谢产物，分析方法有很大的进展，但也易“漏检”酮类酸、醛类酸等有机酸，不利于标本代谢物成分“高通量组学”全面分析，也对碱基、核苷、氨基酸及糖类等物质的全面同步分析的方法，仍显不足；样本是在高温高压下进行的三甲基硅烷化衍生，部分物质易分解，从而“漏检”氨基酸类、胺类、二肽类等物质。最后，面对分析复杂样本的客观需求，面对分析小分子物质数量巨大的难题和面对分析小分子物质种类众多且理化性质各异的难点等。开发样本预处理技术和样本分离及检测技术至关重要，也是制约该领域学科发展的瓶颈。而目前，气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)等仪器很好地解决了样本分离及检测技术难题，成为该应用
的主流分析工具之一。也就是说，剩下的攻关技术主要是开发样本预处理技术，提供一种同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法，是目前研究的热点。
技术实现思路
针对现有色谱柱离子交换法、有机酸萃取法及脲素酶预处理法等分析方法的缺陷，本专利技术的目的在于提供。该方法以生物基样本(尿液、血液、CSF(脑脊液)及组织液等)为检测对象，可以一次性二步衍生法同步分析上述多种物质的代谢中间和终末产物(包括酮类、醛类等物质)，可以二步衍生法同步分析400多种物质。本专利技术的技术方案是(两步衍生法)，具体步骤包括I)取样收集生物基样本；2)定量待测样品对生物基样本进行物理洗脱并收集洗脱液；测定洗脱液中肌酐 含量，确定肌酐浓度，取相当于2. 50 μ moL/ μ L肌酐浓度的洗脱液25 μ L-300 μ L作为待测样品，备用；3)肟化处理过程，即直接在上述待测样品中加入2. 5 μ 1-90 μ I肟化试剂，调PH值至7-14，密封样品并加热至45°C _70°C条件下，充分反应15min_90min，使待测样品完成肟化反应，得厢化反应后的样品；所述厢化试剂的浓度为O. 01 μ g/μ 1-50 μ g/μ I, I亏化试剂选自盐酸羟胺水溶液、甲氧基胺盐-吡啶溶液或乙氧基胺盐-吡啶溶液；4)预处理对肟化后的待测样品进行除磷及除硫、除脲素、除蛋白、超声和离心处理后取离心液b，然后干燥，得残留物，即为预处理后的样品；所述干燥是指氮气吹干或真空浓缩干燥或先真空浓缩干燥再氮气吹干；所述除磷及除硫是指在待测样品中加入O. 08mol/L-l. 2mol/L的钡剂水溶液10 μ L-200 μ L，震荡5-30分钟后离心，收集离心液a ；所述除脲素是指在上述离心液a中加入含脲素酶37 μ L-6V μ L的水溶液30 μ L_260 μ L，于25°C _42°C温度下水浴10-45分钟；所述除蛋白是指再加入相对于离心液a I. 5-6. 7倍体积的溶剂300 μ L-2000 μ L震荡5-30分钟，其中所述溶剂为甲醇、乙醇、丙酮酸、乙晴或吡啶；5) 一次三甲基硅烷化衍生反应在预处理后的样品中加入25μ L_300y L的三甲基硅烷化衍生剂，置干燥加热器上在3°C -20(TC温度下衍生10min-120min，得硅烷化衍生反应后的检测样品；6)采用气质联用分析方法对检测样品中的碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物进行同步检测。步骤(I)中所述的生物基样本包括尿液、血液、脑脊液或组织液等。步骤(2)中所述物理洗脱收集洗脱液是指用O. 5mL-2. OmL去离子双蒸水或1%。盐酸-甲醇溶液分次洗脱，超声、离心、收集洗脱液。步骤(4)预处理过程中所述氮气吹干是利用氮吹仪在流量为O. 001-1. 5mL/秒的99. 99%氮气下进行；所述真空浓缩干燥是在零下70°C至50°C的温度，并在IOPa以内真空度的条件下进行。步骤(4)所述钡剂水溶液包括Ba (Cl) 2或Ba (OH) 2或Ba (NO3) 2水溶液。步骤(5)所述三甲基硅烷化衍生剂选自N，O-双(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺(BSTFA)、N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)、N，O-双(三甲基硅烷基)-2，2，2_三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷按照体积比99 I组成的混合试剂或者N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷按照体积比99 I组成的混合试剂等20余种三甲基硅烷化衍生剂之一。步骤(6)所述采用气质联用分析方法对检测样品进行检测的条件为以正十七烷酸或二十四烷酸或托品酸作为内标物质，采用分流式进样，其中氦气与检测样品的体积比为10-50 I ;进样口温度设定为190°C _250°C，以氦气为载气，流速为O. 5-3. OmL/min，界面温度为260°C -300°C ;质谱检测采用电子离解模式总离子扫描方式，质荷比范围m/z为30-750，扫描周期O. IS-0. 5S，色谱柱采用程序升温，从40°C _70°C开始，以3°C /min_7°C /min的升温速率升温至200°C后停留2min_10min，然后以4°C /mi_12°C /min的升温速率升温至280°C后停留2min-10min，再以4°C /min_12°C /min的升温速率升温至320°C，样本分析时间为8min_60min。 下面对本专利技术做进一步解释和说明本专利技术的原理是I)碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类等代谢产物，虽然数量巨大，物理化学性质各异，但均具有羟基(-0H)、羧基(-C00H)、硫醇基(-SH)、氨基(-NH2 ;_NHR)、酰胺基(-C0NH2)、羟胺基(-0NH)、磺(硫)酸基(-S0H)、硼酸基(本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王益超，
申请(专利权)人：王益超，
类型：发明
国别省市：
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