促进镉积累的基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了促进镉积累的基因及其应用，本发明专利技术从超积累型东南景天分离获得该促进镉积累的基因，其多核苷酸序列为(a)或(b)所示：(a)SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；(b)与(a)中多核苷酸序列根据碱基互补配对原则互补的多核苷酸序列。该基因源自于超积累型东南景天植株，构建该基因的表达载体，利用该表达载体电击法转化农杆菌，应用成熟的农杆菌转化方法侵染拟南芥，最终获得转基因拟南芥植株，该基因在转基因拟南芥植株的叶片上的过量表达可明显增加转基因拟南芥叶片中镉的含量，镉处理后转基因拟南芥的镉含量比以普通拟南芥植株为对照提高了50～64％，在重金属镉胁迫下转基因拟南芥植株中镉的吸收速度明显高于普通拟南芥植株。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种促进镉积累的基因及其应用。
技术介绍
近年来随着我国现代化建设和工业化的飞速发展，由重金属超标所导致的各种环境问题日益严重，并逐渐引起了人们的关注。据报道，目前我国受镉、砷、铬、铅等重金属污染的耕地面积近2000万hm2，约占总耕地面积的1/5，全国每年因重金属污染而减产粮食多达1000多万吨，由此造成的经济损失难以估量。在2014年4月公布的《全国土壤污染状况调查公报》中指出，总体来说，我国的土壤环境状况存在着较大的问题，一些区域的土壤污染问题较为严重，而耕地的质量更加令人担忧，一些已遭到荒废的工矿业地的土壤污染问题也较为突出。由于重金属元素的非降解性和难清除性，如何低成本、高效率、安全地进行治理成为研究热点。植物修复是一种依赖植物的清洁方法，通过植物萃取、植物降解、植物固定、植物挥发、根际过滤等作用，去除环境中的污染物，其成本低廉、技术简单、可持续、对环境友好，受到人们欢迎。目前在发达国家，植物修复广泛用于污染土壤、地表水、地下水、沉淀物、垃圾填埋场等的修复，已达到商业化水平。在重金属胁迫下，虽然绝大多数植物的生长状况会受到明显的抑制并表现出毒害症状，但仍可在自然界中发现一类特殊的植物，其不仅能够在含高浓度重金属的环境中正常生长，还可以在一定程度上吸收并超积累重金属离子，因此将其定义为超积累植物。超积累型东南景天对Cd、Zn、Pb都有一定的超积累能力，其地上部分可累积8000μg·g-1以上的镉而无明显毒害症状。与其他超积累植物相比，超积累型东南景天可超积累Cd、Zn、Pb三种重金属，生物量较为可观，利用无性繁殖有利于进行大量繁殖，并且具有多年生、生长速度快和易收割等特点，在植物修复领域具有较大的潜在价值。面对日益严重的重金属土壤污染问题，寻找重金属超积累的植物修复基因并阐明其功能对于我国重金属污染的治理和修复具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种促进镉积累的基因，其为从超积累型东南景天的叶片cDNA中所分离获得；本专利技术的目的之二是提供含有上述促进镉积累相关的基因的表达载体及转基因拟南芥植株。本专利技术的目的之三是提供含有上述促进镉积累相关的基因在促进拟南芥转基因植株镉积累中的应用。本专利技术公开了一种促进镉积累的基因，其为从超积累型东南景天的叶片cDNA中所分离获得，其特征在于，其多核苷酸序列为(a)或(b)所示：(a)SEQIDNo.1所示的多核苷酸序列；(b)与(a)中多核苷酸序列根据碱基互补配对原则互补的多核苷酸序列。优选的是，其中，其多核苷酸序列还为(c)所示：(c)SEQIDNO.1所示的多核苷酸序列(a)或(b)中多核苷酸序列的cDNA的序列：为SEQIDNO.2所示的多核苷酸序列。一种由促进镉积累的基因所编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。一种含有促进镉积累的基因的表达载体。优选的是，其中，所述表达载体的构建方法具体包括以下步骤：5.1)从超积累型东南景天转录组序列中分析获得Nramp6基因片段，以此片段设计正向引物Nramp6-3F和通用引物B26、反向引物Nramp6-5R和通用引物APL，分别进行3’-RACE和5’-RACE获得了Nramp6基因片段的3’端和5’端基因PCR片段，并直接测序拼接获得DNA序列；5.2)根据所述cDNA序列，在其5’端和3’端非编码区重新设计一对引物Nramp6-F1和Nramp6-R1，提取东南景天叶片总RNA并反转录成cDNA，以此cDNA为模板并以Nramp6-F1和Nramp6-R1为引物进行常规PCR反应，获得Nramp6的cDNA全长序列，以Nramp6全长序列的开放阅读框序列在5’端和3’端重新设计一对引物Nramp6-F2和Nramp6-R2，并以所述cDNA为模板，PCR扩增出Nramp6的编码序列，之后将编码序列连接入pMD19-T克隆载体上。优选的是，其中，所述正向Nramp6-3F和反向引物Nramp6-5R的多核苷酸序列为SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示的多核苷酸序列；通用引物B26和通用引物APL的多核苷酸序列为SEQIDNo.6和SEQIDNo.7所示的多核苷酸序列；引物Nramp6-F1和Nramp6-R1多核苷酸序列为SEQIDNo.8和SEQIDNo.9所示的多核苷酸序列；引物Nramp6-F2和Nramp6-R2多核苷酸序列为SEQIDNo.10和SEQIDNo.11所示的多核苷酸序列。一种含有促进镉积累的基因的表达载体的拟南芥转基因植株。促进镉积累的基因在促进拟南芥转基因植株镉积累中的应用。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种具有增加植物镉吸收积累的植物编码基因，该基因源自于超积累型东南景天植株，构建该基因的表达载体，利用该表达载体电击法转化农杆菌，应用成熟的农杆菌转化方法侵染拟南芥，最终获得转基因拟南芥植株，该基因在转基因拟南芥植株的叶片上的过量表达可明显增加转基因拟南芥叶片中镉的含量，镉处理后转基因拟南芥的镉含量比以普通拟南芥植株为对照提高了50％～64％，在重金属镉胁迫下转基因拟南芥植株中镉的吸收速度明显高于普通拟南芥植株。本专利技术所涉及到的术语定义除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本专利技术的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。术语“碱基互补配对原则”意指在DNA分子结构中，由于碱基之间的氢键具有固定的数目和DNA两条链之间的距离保持不变，使得碱基配对必须遵循一定的规律，这就是Adenine(A，腺嘌呤)一定与Thymine(T，胸腺嘧啶)配对，Guanine(G，鸟嘌呤)一定与Cytosine(C，胞嘧啶)配对，反之亦然。术语“表达载体”意指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点(如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp)，其后的多克隆位点可装载要表达的目标基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促进镉积累的基因，其为从超积累型东南景天的叶片cDNA中获得，其特征在于，促进镉积累的基因的多核苷酸序列为(a)或(b)所示：(a)SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；(b)与(a)中多核苷酸序列根据碱基互补配对原则互补的多核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种促进镉积累的基因，其为从超积累型东南景天的叶片cDNA
中获得，其特征在于，促进镉积累的基因的多核苷酸序列为(a)或(b)所示：
(a)SEQIDNo.1所示的多核苷酸序列；
(b)与(a)中多核苷酸序列根据碱基互补配对原则互补的多核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的促进镉积累的基因，其特征在于，其多核
苷酸序列还为(c)所示：
(c)SEQIDNO.1所示的多核苷酸序列(a)或(b)中多核苷酸序列
的cDNA的序列：为SEQIDNO.2所示的多核苷酸序列。
3.一种由如权利要求1所述的促进镉积累的基因所编码的蛋白，其特征
在于，其氨基酸序列为SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。
4.一种含有如权利要求1所述的促进镉积累的基因的克隆表达载体。
5.如权利要求4所述的含有促进镉积累的基因的克隆表达载体，其
特征在于，所述克隆表达载体的构建方法具体包括以下步骤：
5.1)从超积累型东南景天转录组序列中分析获得Nramp6基因片段，以
此片段设计正向引物Nramp6-3F和通用引物B26，反向引物Nramp6-5和通
用引物APL，分别进行3’-RACE和5’-RACE获得了Nramp6基因片段的3’
端和5’端基因PCR片段，并直接测序拼接获得cDNA序列；
5.2)根据所述cDNA序列，在其5’端和3’端非编码区重新<...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩小娇，方洁，卓仁英，刘明英，乔桂荣，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院亚热带林业研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33