哈茨木霉扩张蛋白及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种哈茨木霉扩张蛋白及其编码基因与应用。本发明专利技术提供一种哈茨木霉扩张蛋白氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，编码该扩张蛋白的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。本发明专利技术制得的扩张蛋白对纤维素酶降解不溶纤维素底物时有比较明显的协同作用，协同指数最高达到2.63，能够有效的提高纤维素酶的降解效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种哈茨木霉扩张蛋白及其编码基因与应用，属于分子生物学

技术介绍
二十一世纪人类面临着资源匮乏的最大挑战，利用现代生物技术开发生物质资源是解决资源问题的重要出路。存在于细胞壁中的纤维素是自然界分布最广、含量最多的一种多糖，是植物细胞壁的主要成分，也是地球上最大量的可再生碳源物质，它的降解是自然界碳素循环的中心环节。据推算，每年地球上由绿色植物光合作用生产的纤维素可达1011 吨之多，而目前全球粮食产量只有2. 2 X IO9吨,如何把纤维素转化成为人类可利用的食物或者有效能源，是人们长期渴望解决的重大课题。然而，纤维素的应用研究一直进展缓慢， 纤维素酶作用天然底物的低效率和实际应用中的高成本是生物质转化和有效利用的限制性瓶颈。随着分子生物学和现代实验技术的发展和应用，已基本弄清纤维素酶催化水解纤维素的“酸/碱催化”双置换作用机制，但仍然未能解决高效降解天然结晶纤维素的问题， 其中主要是忽略了纤维素分子的超分子结构即聚集态结构对其降解的影响。事实上，无定形纤维素和可溶性的纤维寡糖很容易被纤维素外切酶酶解，纤维素与淀粉的结构差异才是纤维素酶解与淀粉酶解速度不同的主要原因。在自然界对纤维素的生物降解过程中，除了酶解机制以外可能还有其它因子和非酶组分破坏天然纤维的结晶结构来起始和协同酶解作用，比如文献报道的一些低分子量组分、短纤维生成因子、羟基自由基等等，其中就有近年来刚刚发现但研究和应用发展迅速的扩张蛋白。扩张蛋白最初在植物中发现，研究表明其可以破坏纤维素的微纤维之间或纤维素和其它细胞壁多糖之间的氢键，但是不具有纤维素酶活性，导致其难以检测活性和进行纯化来研究其作用机制。近来发现丝状真菌(木霉、曲霉等)中也含有具有植物扩张蛋白类似序列的蛋白组分，可以破坏纤维素材料同时不产生还原糖，能够使滤纸、结晶纤维素、半纤维素等天然底物的纤维结构扩张疏松，并且协同作用显著提高纤维素酶对微晶纤维素的水解程度达数十倍以上。相对于植物扩张蛋白，木霉等低等真菌的扩张蛋白具有可以在微生物宿主中异源表达和分子改造的天然优势，对进一步研究和阐明其扩张机理和在纤维素酶酶解天然结晶纤维素过程中各组分的协同作用机制，并进行分子改造和体内、体外的进化改良及异源表达的基因工程研究，最终实现大规模工业化应用都有着重大的意义。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种哈茨木霉扩张蛋白及其编码基因与应用。本专利技术采用如下技术方案实现一种哈茨木霉扩张蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。一种编码哈茨木霉扩张蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。—种插入上述SEQ ID No. 2所不核苷酸序列的表达载体。3一种重组细胞，该重组细胞插入了 SEQ ID No. 2所示核苷酸序列，或者，该重组细胞含有SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的表达载体。上述哈茨木霉扩张蛋白、编码哈茨木霉扩张蛋白的基因、表达载体、重组细胞在降解木质纤维素中的应用。本专利技术首先根据同源保守区域的部分序列设计引物，利用RT-PCR的方法从哈茨木霉的总RNA中扩增出扩张蛋白基因的部分cDNA序列；通过对扩增出的保守域序列进行分析设计引物，利用SMART-RACE技术设计锚定引物，克隆扩张蛋白基因cDNA的5’和3’端， 经过一系列的巢式PCR扩增、筛选和鉴定得到两端的序列；根据得到的扩张蛋白cDNA两端序列设计引物，利用RT-PCR的方法从哈茨木霉的总RNA中扩增出扩张蛋白基因的全长cDNA 序列。该序列含有1467bp开放阅读框，编码489个氨基酸，分子量大小为51KD，等电点pi 为 4. 71。有益效果I、本专利技术制得的扩张蛋白对纤维素酶降解不溶纤维素底物时有比较明显的协同作用，协同指数最高达到2. 63，能够有效的提高纤维素酶的降解效率。2、本专利技术通过哈茨木霉扩张蛋白基因的克隆和异源表达，为进一步功能机制研究、分子改造等提供了新的研究材料。3、本专利技术通过研究异源重组表达宿主的各种细胞生长和发育的活性以及在降解木质纤维素过程中的协同作用对自身生长的影响，为哈茨木霉扩张蛋白基因规模化的工业应用开发打下基础。附图说明图I为哈茨木霉扩张蛋白基因保守区域序列扩增结果示意图；图2为哈茨木霉扩张蛋白基因5’ RACE扩增结果示意图；图3为哈茨木霉扩张蛋白基因3’ RACE扩增结果示意图；图4为哈茨木霉扩张蛋白基因全长cDNA扩增结果不意图；图5为哈茨木霉扩张蛋白基因重组蛋白纯化电泳不意图。具体实施例方式本专利技术的目的是提供一种哈茨木霉扩张蛋白及其编码基因与应用，哈茨木霉扩张蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，编码哈茨木霉扩张蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。下面结合实施例对本专利技术作详细说明。实施例材料准备实施例中所述的哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum),菌种编号为CGMCC No. 3. 5364,购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。I.菌丝制备将哈茨木霉孢子悬液(I. 00 ±O. 05) X IO7个/ml接种涂布纤维平板，培养36h收集菌丝于若干I. 5ml离心管，液氮速冻保存。纤维平板组分如下55wt%料粉(粉料中的麸皮草粉质量比为I : I)、琼脂I.5wt%、水余量。2.总RNA的提取及mRNA的分离纯化称取O. 2g菌丝于预冷的研钵中，用液氮研磨至粉末状。RNA提取方法及mRNA的分离纯化方法参照Qiagen公司产品说明书中关于RNeasy Mini Kit和Oligotex mRNA Mini Kit的相应说明进行操作，悬浮并分装于DEPC处理的无菌三蒸水中，获得悬浊液，贮于-80 0C ο取一份悬浊液，并在230nm、260nm和280nm的条件下检测OD值，计算RNA浓度，同时，通过O. 8%琼脂糖凝胶电泳(90V，40min)检测RNA完整性、含量和纯度。根据OD值计算 RNA 浓度为 I. 25 μ g/μ I、Α260/Α280 = 2. 06、A260/A230 = 2. 31，表明提取的总 RNA 是完整而且蛋白等杂质去除完全，材料在保存和提取过程中没有发生降解，具体计算过程可参见《分子克隆试验指南》第三版，本操作中所有器具均用O. 1% DEPC水处理并烘干，所有试剂均用DEPC处理水配制。 3. RT-PCR扩增扩张蛋白cDNA部分片段3. I引物设计及合成根据对GeneBank中公布的不同物种扩张蛋白和扩张蛋白序列，利用 DNAStar (Lasergene5. 01)软件进行同源功能保守区域序列的分析和比对,发现上游包含一个非常保守的真菌型纤维素结合域(CBD区)并与纤维素酶的CBD序列高度同源，与木霉的纤维素酶CBH、EG进行CBD序列的比对，其中有两部分区域高度保守(可能对结合纤维素的功能起重要作用)；同时序列下游具有同扩张蛋白和相似的催化域(CD区)序列，得到两个较保守的区域(可能与扩张功能有关)。根据推测出的保守区域的序列，利用Primer 5.0 软件设计出上游引物序列5，-TTATATCTGGCTCCTCATG-3，，(SEQ ID NO. 3)及下游引物序列5，-CTCGCAATATCGGAGAGGTC-3，。(SEQ ID 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姚强，宫志远，韩建东，王琦，李瑾，孙涛，万鲁长，任鹏飞，任海霞，
申请(专利权)人：山东省农业科学院农业资源与环境研究所，
类型：发明
国别省市：