本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了针对AFP阳性肝癌细胞的组织特异性重组质粒、重组病毒质粒、重组病毒及其在制备治疗AFP阳性肝癌药物中的应用。本发明专利技术使用具有肝癌组织特异性的AFpg启动子调控DN-PP2Ac表达，使DN-PP2Ac特异性表达于AFP表达阳性的肝癌细胞中，从而避免对正常细胞的影响，具有良好的临床应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种针对AFP阳性肝癌细胞的组织特异性重组质粒、病毒及其应用。
技术介绍
肝癌是发生于肝脏的恶性肿瘤，是临床上最常见的恶性肿瘤之一，居恶性肿瘤的第五位。肝癌在我国属于高发病，一般男性多于女性。目前我国发病人数约占全球的半数以上，占全球肝癌病人的55%，已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手，其危险性不容小视。传统中药中提取的斑蝥素治疗肝癌虽然有显著效果，由于不具有组织特异性，对正常组织的毒副作用明显。斑蝥素作用的靶点是蛋白磷酸酶2A的活性C亚基(PP2Ac)。细胞内蛋白磷酸酶2A的活性C亚基(PP2Ac)是斑蝥素作用的靶点，是一个含&12+和狗2+的金属酶，由309个氨基酸残基组成，其具有α和β两种异构体，有两个不同的基因编码，其同源性高达97%。PP2Ac广泛表达于各种细胞。由于斑蝥素通过抑制PP2Ac发挥杀伤细胞的作用时，并不能够区分肿瘤细胞和正常细胞，因此斑蝥素对正常细胞组织也具有毒性作用。近年来，利用组织特异性基因启动子建立的基因治疗方法，为肿瘤靶向性治疗开辟了新的思路。基因的表达受其启动子的调控，启动子的转录活性与基因转录水平直接相关。某些启动子具有严格的组织特异性，即特定的启动子仅在特定的组织中存在活性。因此，某些基因仅表达于特定组织。如甲胎蛋白AFP的启动子在肝癌细胞中有很高的转录活性，因此AFP主要表达于肝癌细胞。利用肿瘤组织特异性基因的启动子，可以靶向性地在肿瘤细胞中表达某些抗肿瘤基因，从而实现针对肿瘤细胞的干预，减轻甚至避免对正常细胞的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供用于基因治疗的重组载体，通过重组载体将DN-PP2AC导入细胞中，使DN-PP2AC在细胞中过表达，从而抑制PP2Ac的活性，达到类似于斑蝥素的治疗目的，且控制DN-PP2AC特异性表达于肝癌细胞，在正常细胞中不表达，从而避免对正常细胞组织的损伤，减轻毒副作用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案将具有肝癌组织特异性的AFP增强子、pgk启动子和DN-PP2A表达序列重组到腺病毒质粒载体中，使DN-PP2AC的表达受到调控，仅在AFP阳性表达的肝癌细胞中能够表达出DN-PP2A，从而避免了对正常细胞的影响。本专利技术提供一种重组质粒，由AFP增强子、pgk启动子和蛋白PP2Aca的负显性突变体基因与质粒载体重组构建而成。AFP增强子具有组织特异性，但不具有强转录活性；pgk启动子具有强转录活性，但不具有组织特异性。二者结合可同时具有组织特异性和强转录活性。在本专利技术的具体实施例中，AFP基因的增强子序列和磷酸甘油酸激酶(pgk)基因的启动子组合形成的AFpg启动子，结合了 AFP启动子的肝癌组织特异性和pgk启动子的强转录活性，适用于肝癌组织特异性基因治疗。AFP增强子核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，pgk启动子核苷酸序列如SEQ ID No. 3 所示。作为优选，所述PP2Aca的负显性突变体为PP2ACci第199位亮氨酸突变为脯氨酸形成的负显性突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。显性负性作用是指某些信号转导蛋白突变后不仅自身无功能，还能抑制或阻断同一细胞内的野生型信号转导蛋白的作用。具有显性负性作用的突变体被称为显性负性突变 {φ (dominant negative mutant)。DN-PP2Ac (dominant negative PP2Ac)是 PP2Ac 的显性负性突变体。在本专利技术的实施例中，DN-PP2Ac是将PP2Acci第199位亮氨酸突变为脯氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，DN-PP2Ac通过质粒载体导入细胞中，使DN_PP2Ac在细胞中过表达，从而抑制 PP2Ac的活性，其作用类似于斑蝥素。PP2Ac有两种亚型α和β，二者基因序列相近，同源性高达97%，功能基本相同。本专利技术如采用β亚型在同样的位点做显性负性突变，也具有抑制ΡΡ2Α活性的作用。更优选地，所述质粒载体为pGL3-basiC。在本专利技术实施例中，具体提供一种重组质粒，命名为 pGL3-Basic-AFpg-DN-PP2Ac α，其质粒图谱如图 所示。本专利技术还提供一种重组病毒质粒，由AFP增强子，pgk启动子及蛋白PP2Aca的负显性突变体基因与病毒载体重组制备而成。所述病毒载体为腺病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。作为优选，所述病毒载体为腺病毒。在本专利技术的具体实施方式中，采用腺病毒载体系统导入基因，替代方案可选择其他基因导入方式，如逆转录病毒系统、慢病毒系统等病毒载体，或用脂质体、FuGENE等转染试剂进行质粒转染。在本专利技术的实施例中提供的重组病毒质粒其图谱如图9所示。本专利技术还提供一种重组病毒，由所述的重组病毒质粒经包装细胞包装而成。作为优选，所述包装细胞为293细胞。在本专利技术的具体实施例，所获得的重组病毒命名为 Ad-AFpg-DN-PP2Ac α。本专利技术还提供上述重组质粒、重组病毒质粒及重组病毒在制备治疗AFP阳性肝癌药物中的应用。本专利技术将具有肝癌组织特异性的AFpg启动子和DN-PP2A表达序列重组到腺病毒质粒载体中，使DN-PP2AC的表达受到AFpg启动子的调控，使DN_PP2Ac特异性表达于AFP 表达阳性的肝癌细胞中，从而避免对正常细胞的影响。用空质粒对照腺病毒、Ad-CMV-DN_PP2Aca、Ad-AFpg-luciferase以及 Ad-AFpg-DN-PP2Ac α，感染正常人肝细胞系L-02、不表达AFP的肝癌细胞系SK-H印-1、高表达AFP的肝癌细胞系H印G2。采用MTT比色法检测对细胞生长的影响。结果显示空质粒对照腺病毒、Ad-AFpg-luciferase对细胞生长无明显影响。阳参Ad-CMV-DN_PP2Ac α对三种细胞的生长均有抑制作用。d-AFpg-DN-PP2Ac α仅对高表达AFP的HepG2有抑制作用，对不表达AFP的L-02、SK-Hep-I无明显影响。不表达AFP的肝癌细胞系SK-Ifep-I和高表达AFP的肝癌细胞系H印G2分别接种于裸鼠腋下，当形成约IOOmm3大小肿瘤时，向肿瘤内分别注射空质粒对照腺病毒(control)、 Ad-CMV-DN-PP2Ac α、Ad-AFpg-Iuciferase 以及 Ad-AFpg-DN-PP2Ac α，并检测肿瘤生长速度。结果显示，空质粒对照腺病毒、Ad-AFpg-luciferase对肿瘤生长无明显影响。阳参 Ad-CMV-DN-PP2Ac α对两种细胞形成的肿瘤均有抑制作用。Ad-AFpg-DN_PP2Ac α仅对高表达AFP的H印G2形成的肿瘤有抑制作用，而对不表达AFP的SK-Ifep-I形成的肿瘤无明显影响。说明DN_PP2Aca可显著抑制肝癌细胞和正常细胞生长。AFpg启动子可使DN_PP2Ac a 选择性地表达于AFP表达阳性的肝癌细胞中，从而避免对正常细胞的影响。本专利技术采用DN-PP2AC抑制肿瘤细胞生长，其作用机制类似于抗肿瘤药物斑蝥素， 其优势在于可以使用具有肝癌组织特异性的AFpg启动子调控DN-PP2AC表达，使DN_PP2Ac 特异性表达于AFP表达阳性的肝癌细胞中，从而避免对正常细胞的影响，动物试验证实本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，龚斐然，陶敏，
申请(专利权)人：苏州大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
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