本发明专利技术公开了一种几丁质酶的四膜虫表达载体及其在表达几丁质酶中的应用。本发明专利技术提供了一种表达盒，包括序列1自5’末端第9至1126位核苷酸所示HSP70-2基因启动子、序列2所示几丁质酶的编码基因和序列1自5’末端第3835至4312位核苷酸所示HSP70-1基因终止信号。本发明专利技术还提供了含有所述表达盒的重组质粒。该重组质粒电转到四膜虫后，在巴龙霉素药物筛选作用下，能替换掉四膜虫体内原有的大部分rDNA，使外源基因在四膜虫体内大量倍增，实现目标基因的遗传转化，在热激条件下，HSP70-2强启动子启动CBD3基因的高效表达，而且表达的几丁质酶具有生物活性(能水解几丁质)。综上所述，本发明专利技术具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种几丁质酶的四膜虫表达载体及其在表达几丁质酶中的应用。技术背景几丁质(Chitin)又称甲壳素或壳多糖，是以N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)为单体，通过β _1，4糖苷键连接而成的生物多聚体，是自然界中除纤维素外储量最大的生物多聚糖，每年生物合成量达100亿吨。几丁质至今已陆续在微生物、植物、动物中发现，尤其是在真菌细胞壁、节肢动物外骨骼、甲壳类动物的外壳中，几丁质维系其稳定的结构物质， 是绝大部分真菌细胞壁的结构物质，占细胞壁干重的40% -60%。几丁质具有良好的生物相容性、生物降解性，在生物化工、食品、环保、农药等各种领域中有着广泛的应用前景。几丁质同时也具有抗菌、降胆固醇和抗肿瘤的活性。几丁质及相关材料也被应用于污水处理、药物输送、伤口的治愈以及作日常的膳食纤维。但因为分子量大、晶体结构紧密、不溶于水和普通溶剂，限制了几丁质的应用。目前一般用化学降解的方法来制取几丁质的降解产物，但该方法造成较严重的环境污染，而用几丁质酶降解法能克服这个缺点，而且能控制降解的程度。广义的几丁质酶是指所有与几丁质降解有关的酶，除了狭义的几丁质酶，还包括脱乙酰酶、壳聚糖酶、几丁寡糖酶、几丁二糖酶等。狭义的几丁质酶是指催化水解至少含有一个Ν2乙酰葡萄糖胺基团糖苷键的酶，包括几丁内切酶和几丁外切酶。几丁质酶 (Chitinases)广泛的存在于病毒、细菌、真菌、昆虫、高等植物和动物中，并且发挥着作不同的作用。从微生物中分离筛选几丁质酶产生菌的报道最近越来越多，绝大多数的细菌性几丁质酶属于第18家族，其主要功能是分解周围环境中的几丁质，以满足其自身对营养的需求，而对真菌的抑制能力较弱或无。植物产生的几丁质酶大部分为第19族糖基化水解酶类，其功能主要是抑制病原真菌的生长，进行自我防御。现有的表达系统很多。动物细胞表达系统因成本高，使其应用受到限制。常用的大肠杆菌表达系统和酵母表达系统中，大肠杆菌表达系统虽然具有外源基因表达水平高等优点，但是因其缺乏真核生物转录后加工及翻译后加工等功能，其表达的产物往往活性不高或是无活性等，特别是用其表达真核蛋白时。酵母表达系统与动物细胞一样具有真核生物转录、翻译后的多种加工过程，能够表达出多种具有活性的外源蛋白而备受关注，但也存在着明显的局限，如以酿酒酵母为主体的表达系统中缺乏强有力的启动子、分泌效率差、质粒不稳定、难以达到很高发酵密度、只能分泌少量蛋白、表达的蛋白质容易降解、其翻译后加工与高等真核生物有所不同等。四膜虫(Tetrahymena)隶属于原生动物亚门、纤毛亚门、寡膜纲、膜口目、四膜科属，是单细胞真核生物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种几丁质酶的四膜虫表达载体及其在表达几丁质酶中的应用。本专利技术提供的DNA片段(几丁质酶的编码基因的表达盒)，自5’至3’方向依次包括HSP70-2基因启动子、几丁质酶的编码基因和HSP70-1基因终止信号；所述HSP70-2基因启动子如序列表的序列1自5’末端第9至11 位核苷酸所示；所述HSP70-1基因终止信号如序列表的序列1自5’末端第3835至4304位核苷酸所示；所述几丁质酶如序列表的序列2所示。四膜虫的HSP70-2基因启动子能高效启动几丁质酶的编码基因(CBD3基因)的表达。所述几丁质酶的编码基因具体可如序列表的序列1自5’末端第1142至3820位核苷酸所示。所述DNA片段具体可如序列表的序列1自5，末端第9至4304位核苷酸所示。含有所述DNA片段的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌均属于本专利技术的保护范围。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本专利技术的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。 翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。所述重组表达载体具体可为在质粒pD5H8的多克隆位点插入所述DNA片段得到的重组质粒(几丁质酶的四膜虫rDNA表达载体)。该重组质粒电转到四膜虫后，在巴龙霉素药物筛选作用下，能替换掉四膜虫体内原有的大部分rDNA，使外源基因在四膜虫体内大量倍增，实现目标基因的遗传转化，在热激条件下(39°C热激诱导1小时)，HSP70-2强启动子启动CBD3基因的高效表达，而且表达的几丁质酶具有生物活性(能水解几丁质)。所述转基因细胞系具体可为将所述重组质粒导入四膜虫得到的转基因四膜虫。所述转基因四膜虫具体可通过如下方法得到将分别饥饿处理18-24小时的嗜热四膜虫B2086株系和嗜热四膜虫CU^S株系按等数量混合结合10小时后与所述重组质粒混勻，进行电击转化，得到表达所述几丁质酶的转基因四膜虫。所述电击转化的具体参数为300V，25yF，50Q。所述重组表达载体或所述转基因四膜虫可用于生产几丁质酶。本专利技术还保护一种制备几丁质酶的方法，是培养所述转基因四膜虫，使所述转基因四膜虫表达几丁质酶。所述方法中还包括热激处理的步骤，具体可为39°C热激1小时。 所述方法具体可包括如下步骤将所述转基因四膜虫在SPP培养基中培养至细胞密度达 2X105个/ml，然后39°C热激1小时，收集细胞并超声波破碎(超声破碎的具体参数为Φ2 探头，功率200W，破碎10s、间歇30s，共超声破碎5min)，过滤并收集滤液，即为含有几丁质酶的溶液。本专利技术提供的制备几丁质酶的方法，具有如下优点(1)四膜虫广泛分布于全球各地的淡水环境中，以摄取水中的细菌与其他有机质维生，尚未发现对造成人体疾病或对人类健康造成危害，以四膜虫为表达系统，安全性可罪。(2)嗜热四膜虫作为真核生物，具有原核大肠杆菌表达系统所缺乏的真核生物转录后加工及翻译后加工等功能。(3)与其它细胞系(如哺乳动物体细胞)相比，四膜虫为单细胞生物，作为第一种实现细胞同步化的真核生物可以进行无菌纯培养，培养更简单、快速和经济，操作精确度和可控制性强；实验室中，四膜虫营养生长快速小时一代)；同时四膜虫生活周期短且具备真核生物基本生命过程，并且不具有类似于酵母的复杂胞壁结构，却含有可观的细胞膜转运蛋白系统；四膜虫中表达蛋白只有简单的N-糖基化，不存在如酵母中丰富的甘露糖残基修饰，植物中丰富的木糖残基修饰等非哺乳动物中的修饰类型，其独特的生物学使其能够作为理想的表达系统。(4)只需将含有外源蛋白编码基因的四膜虫表达载体经电穿孔法转染到四膜虫体内即可。综上所述，本专利技术具有广泛的应用前景。 附图说明图1为质粒pD5H8的结构示意图。图2为重组质粒pD5H8-CBD3的琼脂糖凝胶电本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周志刚，袁冬霞，缪炜，张宇婷，徐俐，杨雅麟，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。