本发明专利技术公开了一种白唇竹叶青蛇毒中提取磷脂酶A2的方法，通过白唇竹叶青蛇毒预处理；CM-Sephadex?C-50阳离子交换层析；Sephadex?G-75凝胶层析；Q-Sepharose?FF预装柱层析得到纯品。本发明专利技术从白唇竹叶青蛇毒中分离提取出了一种磷脂酶A2，制备方法简单、便于操作、成本低廉，且所得磷脂酶A2纯度较高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物提取领域，具体的说，涉及从一种白唇竹叶青蛇毒中提取磷脂酶 A2的方法。
技术介绍
磷脂酶Adphospholipase A2, PL A2)广泛存在于蛇毒、蜂毒和蝎毒的动物毒液以及哺乳动物的胰腺液中，它是一种Ca2+依赖性酶，能专一的催化甘油磷脂的第二位脂酰键的水解，生成溶血磷脂和脂肪酸。该酶主要由一类结构相似、分子量在14KDa左右的蛋白家族组成，一般含有6到7对二硫键。磷脂酶A2几乎存在于所有毒蛇的毒液中，除了酶活性夕卜，还具有多种生理、药理作用，如心脏毒，细胞毒，肌肉毒，神经毒和神经生长因子等，并有抗凝血、溶血、降血压、抗血小板聚集、诱导形成水肿及引起惊厥等作用。此外，磷脂酶A2还具有抑制细菌生长、诱导细胞凋亡和阻值HIV病毒进入宿主细胞的功能，是研究生物膜、月旨蛋白中磷脂结构和酶的非均相催化机理的重要工具酶。从20世纪50年代首次对眼镜蛇蛇毒的磷脂酶A2进行研究开始(Wittcoff et al, 1951)，迄今已有100多种磷脂酶A2被纯化出来，各种实验表明不同种类的毒蛇含有的磷脂酶A2不尽相同，即使是同一种类的毒蛇，也可能由于生存环境的不同，而导致毒液中的磷脂酶A2的结构和活性有较大的差异。磷脂酶 A2这种特有的化学性质和复杂的生理功能，不仅对其进行生物学研究、结构特征及毒理研究具有重大的理论意义，而且作为药物在治疗肿瘤、心血管疾病等方面也有着重要的应用前景。白唇竹叶青为有毒蛇，主要见于广州、四川、贵州、广西、福建、云南等地。白唇竹叶青蛇毒属于血液循环毒，因为其排毒量较小，人被咬伤后不会马上致命，但是如果不及时采取治疗措施，也会有生命危险。被白唇竹叶青咬伤后，伤者多表现为伤口剧烈疼痛，流血不止，患肢周围红肿，局部地方还会出现水疱、血疱，严重者还有可能出现吐血、便血等症状。 近年来对其毒液的研究报道主要有降纤酶、类凝血酶、5’ -核苷酸酶等，尚未有报道从白唇竹叶青蛇毒中分离制备磷脂酶A2的方法及其磷脂酶A2酶学性质的研究。
技术实现思路
为解决以上技术问题，本专利技术的目的在于提供一种白唇竹叶青蛇毒中提取磷脂酶 A2的方法。本专利技术目的是这样实现的一种白唇竹叶青蛇毒中提取磷脂酶A2的方法，其特征在于按如下步骤进行(1)白唇竹叶青蛇毒预处理收集毒液，将毒液冷冻干燥成粉末状备用，取粗毒冻干粉0. 3 Ig,溶解于5ml pH 5. 2-5. 8,0. 025 0. 05mol醋酸钠缓冲液中，冷冻离心，取上清液待用；(2) CM-Sephadex C-50 阳离子交换层析用 pH 5. 2-5. 8,0. 025 0. 05mol/L 醋酸钠缓冲液平衡CM-kphadex C_50阳离子层析柱；将步骤(1)中上清液上样，用浓度范围在0 0. 5mol/L NaCl的上述缓冲液梯度洗脱，检测波长280nm，流速0. 5 lml/min，收集 :3ml/管，收集活性最强的峰I，冷冻干燥；(3) Sephadex G-75 凝胶层析用 pH 7. 5 8. 0，0. 01 0. 03mol/L Tris-HCl buffer平衡kphadex G_75柱，将步骤( 中收集的冻干样品用相同缓冲液溶解后上样，检测波长280nm，流速0. 15ml/min，收集^iil/管，测各峰磷脂酶活性，收集活性最强的峰IV， 冷冻干燥；(4) Q-Sepharose FF预装柱层析用 pH 7. 5 7. 8，0. 02 0. 05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液平衡Q-kpharose FF预装柱，将步骤(3)中制得冻干样品用上述缓冲液溶解后上样，用浓度范围在0 0. 5mol/L NaCl的上述缓冲液梯度洗脱，流速lml/min，lml/管，收集活性峰II，冷冻干燥即得纯品。上述步骤(1)中采用咬皿挤压法收集毒液，其中冷却离心采用3000 5000r/min 离心10 15min。层析过程中均检测OD^Onm吸光值，采用卵黄平板法测定磷脂酶活性。采用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量大小。采用卵黄平板测定磷脂酶A2活性称取琼脂糖0. 15g，加到IOOml含lmol/L NaCl, 0. 005M/L CaC12的溶液中，高温灭菌15min，取新鲜鸡蛋，乙醇无菌取蛋黄液。灭菌完后，等降温至50°C后，按每IOOml培养基加蛋黄液細1充分混勻后，铺板，待胶凝固后，打孔器打孔，每孔加入IOul待测样品，50°C放置20h，观察平板是否出现透明圈，如果有磷脂酶A2活性，就会出现透明圈；如果没有，则不会出现透明圈。有益效果本专利技术从白唇竹叶青蛇毒中分离提取出了一种磷脂酶A2，制备方法简单、便于操作、成本低廉，且所得磷脂酶A2纯度较高。说明书附1为CM-kphadex C-50阳离子交换层析图谱；图2为kphadex G-75凝胶层析图谱；图3为Q-kpharose FF预装柱层析图谱；图4为本专利技术制备磷脂酶A2的SDS-PAGE图谱。具体实施例方式实施例1(1)白唇竹叶青蛇毒预处理采用咬皿挤压法收集毒液，将毒液冷冻干燥成粉末状备用，取粗毒冻干粉0. 3g，溶解于5ml pH 5. 2，0. 025mol/L醋酸钠缓冲液中，3000 5000r/min冷冻离心10 15min，取上清液待用。(2) CM-Sephadex C-50阳离子交换层析用pH 5. 2,0. 025mol/L醋酸钠缓冲液平衡CM-kphadex C_50阳离子层析柱；将步骤(1)中上清液上样，用浓度范围在0 0. 5mol/ L NaCl的上述缓冲液梯度洗脱。检测波长JSOnm，流速lml/min，收集:3ml/管(参看图 1)。收集活性最强的峰I，冷冻干燥。(3) Sephadex G-75 凝胶层析用 pH 7. 5,0. 25mol/L Tris-HCl buffer 平衡 Sephadex G_75柱，将步骤O)中收集的冻干样品用相同缓冲液溶解后上样，检测波长 280nm，流速0. 15ml/min，收集aiil/管(参看图2)。测各峰磷脂酶活性，收集活性最强的峰IV，冷冻干燥。(4) Q-Sepharose FF 预装柱层析用 pH 7. 5,0. 25mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液平衡 Q-Sepharose FF预装柱。将步骤(3)中制得冻干样品用上述缓冲液溶解后上样，用浓度范围在O 0. 5mol/L NaCl的上述缓冲液梯度洗脱，流速lml/min，lml/管(参看图3)。收集活性峰II，冷冻干燥即得纯品。(5)分子量测定使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度为12%。结果如图 4所示，经上述纯化步骤，样品显示为一条蛋白带，分子量为17200道尔顿。实施例2(1)白唇竹叶青蛇毒预处理采用咬皿挤压法收集毒液，将毒液冷冻干燥成粉末状备用，取粗毒冻干粉lg，溶解于5ml pH 5. 8,0. 03mol/L醋酸钠缓冲液中，5000r/min冷冻离心15min，取上清液待用。(2) CM-Sephadex C-50阳离子交换层析用pH 5.8,0. 03mol/L醋酸钠缓冲液平衡 CM-Sephadex C-50阳离子层析柱；将步骤(1)中上清液上样，用浓度范围在0 0. 5mol本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：余晓东，和七一，邓疆渝，
申请(专利权)人：重庆师范大学，
类型：发明
国别省市：
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