富硒植物材料中硒形态的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种富硒植物材料中硒形态的测定方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：（1）富硒植物材料的预处理：使用提取缓冲液Tris-HCl对粉碎后的富硒植物材料样品进行提取，提取处理后加入纤维素酶对富硒植物材料样品中细胞壁进行破壁处理，然后依次加入有效量的蛋白酶K、蛋白酶XIV进行水解提取得到待测样品溶液；（2）采用氢化物发生——原子荧光光谱法与高效液相色谱法联用分别对标准硒形态溶液和待测样品溶液进行测定。该方法简单易操作，重复性好，所用试剂无毒、无污染。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种富硒植物材料硒形态的测定方法，特别是涉及一种富硒植物材料进行前处理后进行硒形态的测定方法。
技术介绍
硒是人体必需的微量元素之一，是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的组成成分， 具有抗氧化、抗癌、防衰老、提高人体免疫力、保护心脑血管等作用(Rotruck J T，Pope A L, Ganther H E, et al Selenium :biochemical role as a component of glutathione peroxidase. Science, 1973，179，588-590.)。我国有 2/3 的地区缺硒，其中有 1/3 的地区为严重缺硒地区。人和动物体缺硒会导致克山病，大骨节病，动物的白肌病等，除此以外一些癌症，地方性甲状腺障碍等疾病也与低硒环境密切相关(Ip C. Lessons from basic research in selenium and cancer prevention. Journal Nutrition,1998,128, 1845-1854.)。人们日常饮食中的硒包括无机硒和有机硒，其中无机硒毒性较大，中毒量与需要量的界限非常接近，而且吸收和利用率差，生物有效性低，因而被严格限制其使用量。有机硒更利于人体吸收利用，生物活性强，毒性低(卢岚，鲁兵，王春娥.保健食品中有机硒和无机硒的分析探讨.中国卫生检验杂志.2010,20(4) :767-769.)，是更高效、安全的人体补硒形式。硒的生物学功能的发挥主要依赖于其存在形态，特别是有机硒(硒代氨基酸)的形态。因此，准确的检测分析硒代氨基酸形态具有重大的意义，硒形态的研究不仅能指导消费者科学补硒，还能进一步了解硒的生物化学特性和硒在自然界迁移变化的规律。目前，我国测定有机硒含量的方法主要为差减法(秦防.植物中有机硒含量的测定.无锡轻工业大学学报.1998，17 (4) :74-77.),差减法的原理是先利用不同的试剂将待测样品中的有机硒和无机硒分离，因无机硒主要以硒酸根(Se042_)和亚硒酸根(Se032_) 阴离子形式存在，易溶于水。有机硒主要是与蛋白质、纤维素和碳水化合物中的C、N等结合，以大分子的有机物形态存在，所以可利用环己烷或甲苯等有机溶剂萃取出有机硒，再通过测定总硒和无机硒的含量，差减得到有机硒的含量。此方法操作步骤繁琐，重复性差， 只能得到有机硒的总量，对于具体的有机硒形态并不清楚，且所用的环己烷、甲苯等有机溶剂存在一定的毒性。国外对硒形态测定的前处理方法也有报道，Selenium species in leaves of chicory,dandelion,lamb' s lettuce and parsley(Darj a Mazej,Vekoslava Stibil j，et al. Food Chemistry, 2008,107 :75-83.)公开了一种单独利用蛋白酶水解样品然后进行硒形态测试的方法，该方法蛋白酶用量与样品的比例为1 2 1 5，成本很高。所以，开发一种针对以硒代氨基酸为主要分析目标、低成本高效率的样品前处理及测试方法十分有必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有硒形态测定技术特别是提取技术中存在的不足，提供一种操作简便，提取效率高，重复性好，成本低的。为了解决现有技术中的这些问题，本专利技术提供的技术方案如下一种，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)富硒植物材料的预处理使用提取缓冲液Tris-HCl对粉碎后的富硒植物材料样品进行提取，提取处理后加入纤维素酶对富硒植物材料样品中细胞壁进行破壁处理，然后依次加入有效量的蛋白酶K、蛋白酶XIV进行水解提取得到待测样品溶液；(2)采用氢化物发生——原子荧光光谱法与高效液相色谱法联用分别对标准硒形态溶液和待测样品溶液进行测定；用峰高或峰面积进行定量，用数据处理中的外标法，绘制标准工作曲线后保存，然后将样品峰积分处理，利用外标法校正，按照公式(1)可计算得到待测样品溶液中硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸 (SeMet)的含量；X = CXV/m (1)其中X为样品中待测物质的含量，单位为微克每千克(yg/kg) ；C为待测液中该物质的浓度，单位为微克每升(yg/L) ；V为测定液体总体积，单位为毫升(mL) ；F为稀释倍数；m为称样质量(体积)，单位为克(g/mL)。优选的，所述方法中采用的提取缓冲液为Tris-HCl，其浓度为lOOmmol/L，pH7. 5， 样品与提取缓冲液的比例为1 25 1 100(m V)。优选的，所述方法中提取方法采用超声提取，提取时间为10 30min。优选的，所述方法中纤维素酶与称取的富硒植物材料样品的质量比例为1 1 1 10，破壁处理温度控制在40 55 °C。优选的，所述方法中蛋白酶K与富硒植物材料样品的质量比例为1 20 1 200 ；水解温度控制在40 55°C。优选的，所述方法中蛋白酶XIV与富硒植物材料样品的质量比例为1 20 1 200 ；水解温度控制在30 45°C。优选的，所述方法中水解处理后样品溶液在0 10°C下，离心处理后上清液过 0. 2 0. 5 μ m的滤膜，制得待测上清液。优选的，所述方法中高效液相色谱法和氢化物发生——原子荧光光谱法联用时液相色谱及原子荧光条件为流动相(40mmol/L(NH4) 2HP04,pH 6. 0)；流速 lmL/min ；进样体积 100 μ L ；蠕动泵转速65rpm ；灯电流/辅阴极100mA，45mA ；光电倍增管负高压300V ；载气流速300mL/min ； 屏蔽气流速700mL/min。优选的，所述方法中高效液相色谱法和氢化物发生——原子荧光光谱法联用时氢化物发生条件是还原剂成分0.35 % NaOH+1. 2 % NaBH4,流速:6mL/min ；氧化剂成分0. 35 % Na0H+0. 8% H2O2，流速6mL/min ；载流10% HCl，流速6mL/min。优选的，所述方法开机后对液相色谱及原子荧光进行设置，待仪器稳定后，先做标准曲线，然后测定处理好的样品溶液，在上述条件下硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的保留时间依次为2. 6min,3. 2min,4. Omin, 5. Omin，待测样品中的硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋5氨酸(SeMet)的色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在士5%之内即认为为该待测定物质。本专利技术涉及一种富硒植物中硒形态的测定方法，是利用超声提取后，再结合温和的酶水解，使富硒植物中的含硒化合物充分水解并利用仪器进行硒形态的测定。所述的以硒代氨基酸为主要硒形态指标的测定方法方法，步骤描述如下(1)称取粉碎过筛的富硒植物于塑料离心管中，加入提取缓冲液 Tris-HCl(100mmol/L，pH7. 5)，混勻。样品与提取液的比例为(m V)为1 25 1 100 ；(2)将混合液放入超声清洗器超声提取10 30min ；(3)先加入纤维本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱元元，刘志奎，焦文宁，
申请(专利权)人：苏州硒谷科技有限公司，
类型：发明
国别省市：