一种新的含有乙型肝炎病毒稳定复制的细胞系、制备方法及用途技术

本发明专利技术提供了一个新的含有乙型肝炎病毒稳定复制的细胞系、该细胞系的制备方法以及用该细胞系在抗乙肝病毒药物筛选中的应用。本发明专利技术的细胞含有中国人特有的乙肝病毒基因，可大量分泌E抗原和S抗原，使研究抗中国乙肝病人药物有准确靶标。

【技术实现步骤摘要】
一种新的含有乙型肝炎病毒稳定复制的细胞系、制备方法及用途专利技术所属领域本专利技术属于基因工程领域，具体地说，本专利技术涉及一种含有肝炎病毒稳定复制的细胞、制备该细胞系的方法和该细胞用途。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球范围内的一个重要公共卫生问题。据世界卫生组织报道，截至2008年止，全世界有超过20亿人感染过乙肝病毒，其中也有超过3. 5亿人口转变成为慢性携带者，每年死于由乙肝引起的肝纤维化以及原发性肝癌的人数差不多累积到60万。我国是乙型肝炎高发区。按照1992年全国乙型肝炎血清流行病学调查结果普通人群HBV感染阳性率为10%推算，我国现有慢性无症状的乙型肝炎病毒携带者超过1亿，每年数十万名患者死于肝硬化、肝癌等乙肝相关疾病。目前乙肝的发病机制尚不十分清楚。近年来乙肝病毒基因型与肝炎发生发展的关系日益引起学者的重视，是国内外研究的热点问题。乙肝病毒基因型分布有明显的地理区域性，而且差异较大，乙型肝炎病毒感染后的临床表现及致病进程除了与宿主免疫状态、感染时机等有密切关系之外，还可能与感染HBV的基因型关系密切。此外，随着抗病毒药物的广泛使用和临床研究的大量开展，越来越多的证据表明药物的抗病毒效果与HBV基因型差异的有关系。防治乙型肝炎需要对HBV有更为深入的基础研究，研究者通常把可自主复制的 HBV基因组瞬时转入到肝癌细胞系中，以研究HBV的复制和致病机理。瞬时转染的基因组游离于细胞中，并不整合到染色体上，一般在1-4天后就收获细胞分析样本。瞬时转染HBV 基因组与HBV本身整合到染色体中的持续性有根本性差别，因此含有HBV稳定复制的细胞系对于研究更具有实际意义，结果也更为准确和可靠。现在全世界范围内用于乙肝研究的细胞模型主要是基于分离的一个D型乙肝病毒基因组所构建H印G2. 2. 15 (Sells MA, Chen ML,Acs G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987 ;84 :1005—1009)。 H印G2. 2. 15所含有的HBV的D型基因型在全球范围内流行，尤其为非洲北部、地中海地区、 中东和印度的优势基因型。在我国，B和C基因型的HBV占了绝大部分，而D基因型在我国分布很少，这就使得H印G2. 2. 15细胞在我国的HBV基础研究中有很大的局限性。更重要的是，HepG2. 2. 15细胞生长较慢，分泌到细胞上清中E抗原和S抗原很低，无法确保结果的有效区分性和准确性。在我国乙肝病毒的防治中，缺少我国特有的乙肝病毒的细胞研究模型， 使得探索新的抗病毒药物无准确靶标，无法扭转目前中国的乙肝感染高发病率和高病死率现状。专利技术
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种新的含有乙型肝炎病毒稳定复制的细胞，该细胞含有中国特有的乙肝病毒基因，可大量分泌E抗原和S抗原，使研究抗中国乙肝病人药物有准确靶标。本专利技术的另一个目的是提供一种制备该细胞系的方法。本专利技术还提供了一种该细胞在抗乙肝病毒药物筛选上的用途。本专利技术公开了一种新的含有乙型肝炎病毒稳定复制的细胞，其特征在于，该细胞含有人工转入的中国人的乙型肝炎病毒基因，且乙型肝炎病毒基因具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，该细胞是人肝细胞Huh7. 37细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC C201185。Huh7. 37细胞是将HBV基因转入Huh7细胞系，并经G418压力筛选培养而获得一株稳定的细胞系。该细胞系能在普通DMEM培养基中稳定生长，长期培养过程中可检测到乙肝基因组DNA复制，并能持续稳定地表达S抗原和E抗原分泌至细胞培养液中。本专利技术的公开了制备Huh7. 37细胞系的方法。该方法步骤如下1)HBV全基因组的克隆从中国乙肝病人血清中提取到HBV病毒DNA，并扩增到 HBV全基因组；2) HBV侵染性克隆的构建运用重叠延伸PCR技术构建HBV1. 3倍体，然后将HBV1. 3倍体插入到已含有NEO基因的pBlueScrip II KS (+)载体上，构建成 pBlue-HBVl. 3-NE0 侵染性克隆；3)转染与筛选转染质粒pBlue-HBVl. 3-NE0到Huh7细胞系，G418压力筛选出稳定复制HBV的细胞系。本专利技术还公开了优选的，有效制备含有HBV稳定复制的细胞系的方法，该方法包括如下步骤1)HBV全基因组的克隆从中国乙肝病人血清中提取到HBV病毒DNA，并扩增到 HBV全基因组。2)HBV侵染性克隆的构建将整个HBV 1. 3倍体分成了四段序列构建，分别是片段 1，1050-1822 ；片段 2，1823-3215 ；、片段 3，1-1822 和片段 4，1823-1990 ；采用重叠延伸 PCR (SOE PCR)技术分三轮完成HBV1.3倍体构建；在第一轮PCR中，得到以上四个不同的片段；然后，经过重叠延伸将1、2片段和3、4片段分别拼接起来，得到片段A和片段B ；在第三轮PCR中，让片段A、B搭桥延伸出整个HBV的1. 3倍体；将G418抗性基因NEO连接在载体 pBluescript II KS (+)中得到 pBlue-NEO，通过酶切将 HBV1. 3 倍体连接在 pBlue_NE0 上， 得到侵染性克隆pBlue-HBVl. 3-NE0。3)转染与筛选采用脂质体转染方法转染含抗性基因的侵染性克隆 pBlue-HBVl. 3-NE0,再通过ELISA检测上清中的蛋白标志物E抗原和S抗原的表达情况， 确定转染阳性细胞；消化所有细胞，然后平均分配到多个细胞平板中，保证每个孔中细胞的覆盖率为30% ；加入含G418选择培养基，3-5天换一次液，15天后，剩下的细胞形成一些白色的集落，经消化后将细胞集落挑至96孔板中，细胞长满后检测相关蛋白的表达，通过有限稀释方法得到高表达蛋白及HBVDNA的细胞系，最终建成稳定复制B型HBV基因组的 Huh7. 37细胞系。该细胞命名为“Huh7. 37细胞”，含有人工转入的中国人的乙型肝炎病毒基因，且乙型肝炎病毒基因具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，该细胞是人肝细胞Huh7. 37细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201185，保藏日期是2011年8月20日。4本专利技术还公开了 Huh 7. 37细胞在抗乙肝病毒药物筛选中的应用。本专利技术中的质粒载体pBlueScrip II KS (+)可通过市售商业生物公司获得，如 Thremo Fisher Scientific inc.等公司，Huh7，HepG2, HepG2. 2. 15 细胞可通过市售商业生物公司或菌种保藏机构获得，如中国典型培养物保藏中心保藏有该细胞，研究者可向该中心索取。在本专利技术中，申请人公开了筛选特异性的抗乙肝药物方法，该方法包括下列步骤1)细胞准备用常规方法培养Huh7. 37细胞，维持细胞良好的生长状态，铺96孔细胞板，至于含5% C02、37度的细胞培养箱培养，直到细胞生长至覆盖率大于90% ；2)待筛选药物的处理准本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱应，吴建国，任文丹，赵凡鹏，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：