产生产量大大提高的PHB缺陷型鞘氨糖（定优胶）的鞘氨醇单胞菌菌株制造技术

提供了具有改良的鞘氨糖(sphingan)产量的PHB缺陷型鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)菌株。鞘氨醇单胞菌菌株中的某些是因影响PHB和鞘氨糖合成的某些遗传修饰的组合而展现产率和产量巨大改良的产定优胶菌株。此外，产自此类菌株的鞘氨糖具有极佳的特征，包括改良的过滤性、澄清度和改良的流变学改性特征。所提供的鞘氨糖因而在多种商业和工业用途中是高度期望的，所述商业和工业用途包括个人护理物品、水泥应用和油田应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请大体上涉及对产生高产量的具有改良过滤性的定优胶(diutan)的PHB缺陷型鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)菌株的构建。另一方面，本申请涉及从产生高产量的具有改良过滤性的定优胶的PHB缺陷型鞘氨醇单胞菌菌株产生的定优胶。2.相关技术描述大量鞘氨醇单胞菌属细菌产生称作鞘氨糖(sphingan)的多糖，所述多糖具有带大体上保守的四糖骨架结构和不同侧链的相关结构(参考文献第1、6、7、8、10号)。商业上生产用于食品、油田或个人护理应用的鞘氨糖结冷胶(gellan)、威兰胶(we 1 an)、鼠李胶 (rhamsan)和定优胶。鞘氨糖多糖的价值在于其改变水性溶液流变学即增稠液体、悬浮固体、稳定乳剂或形成凝胶和膜的能力。鞘氨糖在结构上互为相关，但不完全相同。鞘氨醇单胞菌属的通常成员和其产生的鞘氨糖包括多沼鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas elodea)ATCC31461，该菌产结冷胶(S-60)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)ATCC31555，该菌产威兰胶(S-130)；鞘氨醇单胞菌ATCC 31961，该菌产鼠李胶(S-194)；鞘氨醇单胞菌ATCC 53159，该菌产定优胶(S-657)；鞘氨醇单胞菌ATCC 31554，该菌产尚未命名的多糖(S-88)；鞘氨醇单胞菌 ATCC31853，该菌产尚未命名的多糖(S-198)；鞘氨醇单胞菌ATCC 21423，该菌产尚未命名的多糖(S-7)；鞘氨醇单胞菌ATCC 53272，该菌产尚未命名的多糖(NW-Il)；鞘氨醇单胞菌 FERM-BP2015(之前的广泛产碱菌(Alcaligenes latus) B-16)，该菌产阿卡兰胶(alcalan) (生物聚合物B-16)等。对鞘氨醇单胞菌(Sphingomonads)和其产生的多糖的描述可以见于例如美国专利第4，377，636号；第4，326，053号；第4，326，052号和第4，385，123号(关于ATCC 31461及其S-60多糖)；美国专利第4，342，866号(关于ATCC 31555和S-130)；美国专利第4，401，760号(关于ATCC 31961和S-194)；美国专利第5，175，278号(关于 ATCC 53159 和 S-657)；美国专利第 4，331，440 号和第 4，535，153 号(关于 ATCC 31554 和 S-88)；美国专利第4，529，797号(关于ATCC 31853和S-198)；美国专利第3，960，832号 (关于ATCC 21423和S-7)；美国专利第4，874，044号(关于ATCC 53272和NW-11)；美国专利第5，175，279号(关于FERM BP-2015和B-16)，以与本文公开内容无不一致处的程度将所述每一篇文献通过引用整体并入本文。通过菌株鞘氨醇单胞菌ATCC 53159的发酵，制备了特定鞘氨糖定优胶(也称作杂多糖S-657)(参考文献第17号)。定优胶在水性溶液中展现独特的流变性质，包括高热稳定性、极佳的悬浮性质和低浓度下生成高粘度的能力。所述定优胶多糖对诸如水的极性溶剂赋予显著的假塑性，以致定优胶能用作有微粒悬浮、摩擦减小、乳剂和泡沫稳定化、滤饼沉淀和过滤控制能力的流变改性剂。因此，已发现定优胶在包括如美国专利第6，110，271 号所公开的水泥基系统(cementitious system)在内的多种背景下作为流变改性剂的工业效用，以与本文公开内容无不一致处的程度将该美国专利通过引用整体并入本文。定优胶由重复单元构成，所述重复单元具有由[—4)-a -L-鼠李糖-(1 — 3)-i3_D-葡萄糖-(1 — 4)-i3_D-葡糖醛酸-(1 — 4)-i3_D-葡萄糖-(1 —]构成的骨架和结合至(1 — 4)连接的葡萄糖残基的二 -糖L-鼠李糖侧链(参考文献第2、7 号)。每个重复单元将两个0-乙酰基结合至(1 — 3)连接的葡萄糖的2’和6’位(参考文献第4号)。在阐明定优胶和其它鞘氨糖生物合成潜在的遗传学和生物化学方面已取得进展。 用于鞘氨糖S-88、S-7和结冷胶生物合成的基因已被鉴定(参考文献第5、12、13、15号)。 已生化分析了数种骨架结构糖基转移酶的基因(参考文献第11、14号)，这有基因gelC和 gelE，其潜在地参与链长度决定(参考文献第9号)。用于合成糖核苷酸前体的基因中的数种也已阐明(参考文献号第12号)。较少定义多聚、分泌和多糖分子长度控制的遗传学和生物化学。已鉴定参与定优胶生物合成的基因簇，包括用于糖基转移酶的基因、编码用于合成前体分子dTDP鼠李糖的酶的基因以及用于分泌该多糖的基因(参考文献第3号)。表明含有前述簇中的一些基因的质粒例如PS8和p)(6将定优胶产量提高约10 %，并且特别地，发现一质粒(PS8)显著改良野生型菌株的定优胶流变性质(参考文献第18号)。通常用于产生定优胶和其它鞘氨糖的生长条件还促进内部储存聚合物聚羟基丁酯(“PHB”)的产生，PHB—般被认为是不期望的副产物，并难以在鞘氨糖制备中移除。PHB 可以形成干扰澄清度和过滤性的小的不溶微粒，从而限制鞘氨糖的可用性。例如，PHB微粒造成的混浊能够限制家用和个人护理产品的应用性，在这些产品中外观对于消费者接受而言是关键的。此外，某些油田用途需要过滤性；然而，PHB微粒可以塞住油田岩石形成物中的小孔，从而阻止在处理井之后鞘氨糖溶液的流动和/或粗油的回流。最后，由于PHB合成和鞘氨糖合成竞争可用碳源，因而PHB合成可对鞘氨糖产量产生一些不利影响。因此，已尝试在产鞘氨糖菌株中清除PHB的产生。参考文献第沈号描述了化学诱变后分离的多沼鞘氨醇单胞菌(产结冷胶的物种)菌株。称作LPG-2的该菌株已降低PHB 的产生，但产生质量和产量不一致的结冷胶。清除PHB的产生的更为靶向的方法由对PHB合成所需基因phaC基因的缺失来承担(参考文献第20号)。从产定优胶菌株(ATCC 53159)中精确缺失phaC可再现地导致低下生长和严重减少的定优胶产率(菌株NPD3和NPD6)。这些菌株展现增加的碳水化合物水解和有机酸积累，从而提示PhaC在维持正常细胞代谢中的关键作用。随后分离具有较少受损定优胶产率的衍生物。两种独立的衍生物PDD3和PDD6具有未表征的一个或多个自发突变并仍为PHB缺陷型(分别地，ATCC保藏号PTA-4865和PTA-4866)。虽然已报道恢复多达 90%的总定优胶产量(参考文献第20号)，但是仅在大大增加的培养物生长时间后获得该产量，并且该产量尚不是持续可再生的。在标准生长条件下，这些菌株的定优胶产率和产量仅为野生型水平的大约一半。概述有鉴于前，需要克服作为PHB缺陷型菌株特征的低鞘氨糖产率。本公开内容通过提供遗传修饰的鞘氨醇单胞菌菌株，来解决本领域中的这一需要，所述遗传修饰的鞘氨醇单胞菌菌株不仅缺少PHB的产生而且提供惊人高的定优胶产率。预料不到的是，现已表明， 质粒pS8和p)(6 (它们在产PHB菌株中仅带来中等的定优胶产率改良)大大改良PHB缺陷型菌株中的定优胶产率。定优胶产率的大大改良是特别令人惊讶的，这是因为所述质粒包含参与定优胶生物合成的基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.07.31 US 12/533,6491.鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)的突变菌株，所述突变菌株包含至少一种基本上或完全清除聚羟基丁酯(PHB)的产生的遗传修饰；至少一种导致增加的鞘氨糖产生的遗传修饰，所述遗传修饰包括提高参与鞘氨糖合成的至少一种基因的表达的遗传修饰，其中所述参与鞘氨糖合成的至少一种基因选自由质粒pS8中的插入物(SEQ ID NO :1)、质粒p)(6中的插入物(SEQ ID NO :54)、菌株ATCC PTA-10102所含质粒中的插入物、菌株ATCC PTA-10103所含质粒中的插入物所含基因及其鞘氨醇单胞菌同源物组成的组；借此，所述鞘氨醇单胞菌属的突变菌株能够相对于含有所述至少一种基本上或完全清除PHB的产生的遗传修饰并缺少所述至少一种导致增加的鞘氨糖产生的遗传修饰的同类系菌株，产生增加的大致上无PHB的鞘氨糖产生。2.如权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中所述鞘氨糖选自由定优胶、 S-7、结冷胶、S-88、威兰胶、鼠李胶、S-198、NW-Il和阿卡兰胶组成的组。3.如权利要求2所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中所述鞘氨糖是定优胶。4.如权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中所述参与鞘氨糖合成的至少一种基因选自由以下组成的组鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)ATCC 53159基因dpsS、 dpsG、dpsR、dpsQ、dpsl、dpsK、dpsL、dpsj、dpsF、dpsD、dpsC、dpsE、dpsM、dpsN、atrD、atrB、 dpsB、rmlA、rmlC、rmlB、rmlD、orf7、orf6、orf5 和其鞘氨醇单胞菌同源物。5.如权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中参与鞘氨糖合成的至少一种基因的所述鞘氨醇单胞菌同源物衍生自选自由多沼鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas elodea) ATCC 31461、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp. )ATCC 31555、鞘氨醇单胞菌ATCC 31961、鞘氨醇单胞菌ATCC 53159、鞘氨醇单胞菌ATCC 31554、鞘氨醇单胞菌ATCC 31853、鞘氨醇单胞菌ATCC 21423、鞘氨醇单胞菌ATCC 53272和鞘氨醇单胞菌FERM-BP2015组成的组的鞘氨醇单胞菌物种。6.如权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中所述至少一种导致增加的鞘氨糖产生的遗传修饰选自由以下组成的组(i)参与鞘氨糖合成的至少一种基因与异位启动子的可操作连接；( )参与鞘氨糖合成的至少一种基因的每细菌染色体的拷贝数增加；和(iii)其任意组合，其中所述参与鞘氨糖合成的至少一种基因中的每一种为细菌染色体或染色体外元件所包含。7.如权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中所述至少一种基本上或完全清除PHB的产生的遗传修饰是使选自由phaA基因、phaB基因和phaC基因或其组合组成的组的基因组成性或条件性失活或缺失的突变。8.如权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中所述至少一...

【专利技术属性】
技术研发人员：南茜·E·哈丁，Y·N·帕特尔，托德·塔拉舍克，
申请(专利权)人：CP凯尔科美国公司，
类型：发明
国别省市：