本发明专利技术公开了一种检测微RNA功能的双荧光报告系统的制备方法及应用，其制备步骤：A、PCR扩增获得mCherry基因序列，插入pEGFP-C1载体替代其EGFP序列，构建成载体pmCherry-C1；B、以RNAi-ReadypSIREN-RetroQ质粒为模板，PCR扩增获得人U6启动子基因，插入载体pmCherry-C1，获得质粒phU6-mCherry-C1；C、PCR扩增获得pAdtrack-CMV质粒上358-1944区间的基因序列，其中带有CMV启动子和EGFP表达框序列，将该序列插入质粒phU6-mCherry-C1中，获得质粒pMGhU6。该pMGhU6质粒即为同时含有mCherry报告基因、内参照EGFP、及微RNA和其靶标序列插入位点的双荧光报告系统。该报告系统可用于微RNA对其靶标序列表达抑制功能检测。检测方法易行，操作简便，只需转染一个质粒既可实现微RNA的功能检测。借助荧光显微成像，该系统还可以用于可视化检测单个活细胞内微RNA对其靶标的抑制功能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微RNA功能检测的
，更具体涉及一种检测微RNA功能的双荧光报告系统的制备方法，同时还涉及一种微RNA功能的双荧光报告系统的用途。在同一载体中利用不同的真核启动子，既可转录微RNA，又能转录红色荧光蛋白mCherry基因，并且在mCherry基因的3’ -UTR区可连入微RNA作用的靶标序列以控制mCherry的表达；同时， 该载体还能独立表达绿色荧光蛋白EGFP作为内参照。实验中，通过测量绿色荧光蛋白EGFP 和红色荧光蛋白mCherry的荧光强度比值，与对照组相比较就可以评价微RNA的抑制功能。 该新系统为一种简单、有效、方便、可靠的微RNA功能检测的质粒报告系统。
技术介绍
微RNA (miRNA)是一类大小18_Mnt的内源表达的非编码RNA，它广泛分布于大多数的真核生物中。至今，通过遗传学、分子克隆、生物信息学预测等方法已在上百种生物中鉴定出万余种miRNA，它们遍布存在于动物、植物、真菌等多细胞真核生物甚至病毒中。并且，miRNA在各个物种间具有高度的进化保守性，其中在茎部的保守性更强，在环部则容许更多的突变位点存在。截至目前，在人类细胞中发现的miRNA就多达721种，在各类病毒中也发现有200多种。miRNA作用于mRNA转录后阶段以调控基因的表达，进而参与细胞内一系列生物学过程或参与病毒复制过程等。目前，miRNA的研究主要包括miRNA基因的寻找、鉴定及其对应的靶基因的寻找、 验证等。其基本思路是首先利用计算学方法预测miRNA基因及其靶基因，然后通过直接或间接方法来测定验证其功能。目前，绝大部分预测miRNA基因的计算学方法多是基于miRNA 前体特殊的生物学特征，如其在所有物种中都具有的保守的发夹结构及比其他RNA更稳定的构象等。在预测miRNA的基础上，对于miRNA鉴定及其表达分析则是另一个研究重点。一般地，miRNA的鉴定及miRNA表达分析大多还是使用如RT-PCR、分子克隆、测序、Northern blot.microarray等传统方法。利用microarray对miRNA作表达谱分析在一定程度上可做到全局，高通量并具一定的重复性，但这种基于核酸杂交信号检测的方法有着固有的缺陷， 如最多只能做到半定量检测，不适合用来鉴定新miRNA等。为了克服这些缺陷，“下一代测序技术”，即基于边合成边的测序方法(sequencing-by-synthesis，SBS)，也被用于miRNA 鉴定及表达分析。如利用SBS技术对急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia)相关的miRNA作miRNA表达谱分析，不但鉴定了大量已知的miRNA还鉴定了 55种新的miRNA。预测并鉴定了 miRNA，接下来就是对其靶基因的寻找及验证，以研究其真正的生物学功能。自发现miRNA以来，功能验证及靶基因验证一直都是阐述miRNA重要性及生物学意义的重要研究内容。然而，对于miRNA的功能验证及靶基因验证，难度很大，目前方法也不是很多。如上所述，以人类为例，据推测人类基因组编码大概1000种miRNA，而一个特定的miRNA能以不同结合效率靶向几十甚至上百条mRNA ；反过来，一条mRNA也可能被多条 miRNA靶向。这样就建立了一套极其复杂的miRNA调控基因表达的网状系统。比起miRNA靶基因的预测过程，miRNA靶基因的验证仍是一个极为费时费力的过程。目前，对于验证 miRNA靶基因仍没有便捷的方法。迄今最为常用的还是基于报告基因实验对miRNA进行功能验证和靶基因验证。基于报告基因实验的方法是一种间接检测手段。在此基础上结合传统的实验方法，如缺失突变特定miRNA基因、沉默特定miRNA基因的表达、过量表达特定 miRNA等方法，后通过qRT-PCR、miCr0array等手段观察假定靶mRNA的表达变化情况，既可综合判断miRNA对靶基因的抑制作用。常用的报告基因有荧光素酶，有时也用荧光蛋白(如EGFP)等。目前所用的报告基因系统一般包括两个载体一个载体用来转录miRNA，另一个载体则一般是在报告基因的3’ -UTR区连入多个重复的根据miRNA序列设计的非完全互补序列(功能验证)或连入假设的靶基因3’-UTR序列(靶基因验证)。实验时，将两个载体共转染于细胞中，转染一定时间后根据与对照组的比较结果评判报告基因表达的抑制情况。目前的报告基因系统用于miRNA功能检测存在许多缺陷。譬如，两个质粒同步转染难以保证目的mRNA及其靶标等基因的等量或同比例表达，实验重复性不好。更为重要的是，现有的报告系统如荧光素酶系统检测信号时需要破碎或固定细胞，无法在活细胞内检测miRNA的功能等。所以，本研究设计了一种新型的双荧光蛋白报告系统，用于miRNA功能验证。该新系统基于在同一质粒载体中同步表达微RNA、融合红色荧光蛋白的微RNA靶标序列、及作为内参照的绿色荧光蛋白，并且分别由三个独立的启动子控制它们的转录及表达。通过测量 EGFP和mCherry的荧光强度比值，就可以评价微RNA对其靶标的抑制功能。该系统为一种简单、有效、方便、可靠的微RNA功能检测的质粒报告系统。并且可用于活细胞内可视化地检测微RNA的功能。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种微RNA功能的双荧光报告系统的制备方法。在同一载体中利用不同的真核启动子，既可转录出功能待测的目的微RNA，又能转录荧光蛋白 mCherry基因，并且可以在mCherry基因的3’ -UTR区连入微RNA作用的靶标序列以控制 mCherry的表达；同时，该载体还能独立表达另一种绿色荧光蛋白EGFP作为内参照。通过测量EGFP和mCherry的荧光强度比值，与对照组相比较就可以评价微RNA的抑制功能。本专利技术的另一个目的在于提供了一种双荧光报告系统在微RNA的抑制功能检测中的应用。该报告系统用于微RNA(如miR30)功能检测，检测方法易行，操作简便，只需转染一个质粒既可实现微RNA的功能检测。借助荧光显微成像，该系统还可以用于可视化检测单个活细胞内微RNA对其靶标的抑制功能。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施一种微RNA功能的双荧光报告系统的制备方法，其步骤是A、自质粒 pRSET-B-mCherry (Dr. Roger Y. Tsien 惠赠)上通过 PCR 扩增获得 mCherry基因序列，利用酶切位点Nhe I和Bgl II把mCherry基因插入pEGFP-Cl (购自 Clontech)载体上，替代pEGFP-Cl上的EGFP序列，构建成载体pmCherry-Cl ；B、以 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ 质粒(购自 Clontech)载体为模板，PCR 扩增获得 U6 启动子片段，PCR 使用的上游引物5，-CAACATACGCGTTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTC C-3，(Mlu 1)，下游引物5，-ATGGATACGCGTGCGGCCGCGACTGATATCCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGAT-3，，PCR 扩增条件为:94°C 5min，一个循环；94°C 45s, 60°C 50s, 72°C 30s，进行 30 个循环；最本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：崔宗强，尤祥宇，张先恩，张治平，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：
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