本发明专利技术提供了一种检测卵巢癌易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测MTHFR基因上C677T，GSTT1基因是否缺失(Null/Present)，CYP1B1基因上Leu432Val的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明专利技术的试剂盒通过检测与卵巢癌发生密切相关的3个单核苷酸多态性位点的基因型来评估女性卵巢癌患病的风险级别，并最终根据每一位受检者的基因检测结果从基因层面指导女性有针对性的预防卵巢癌的发生，降低卵巢癌的发病几率。本发明专利技术采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确，可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种卵巢癌易感基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估卵巢癌发病的风险级别，并作为预防和治疗卵巢癌的方向指导。
技术介绍
卵巢癌是女性生殖器官常见的肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位。但因卵巢癌致死者，却占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁。卵巢癌之所以是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，是因为其发病隐匿、进展迅速，70%-80%的卵巢癌患者发现时已为晚期，5年生存率仅为20% -30%，而早期卵巢癌患者的生存率可达 90%。因此提高卵巢癌的早期诊断水平、争取有利的治疗时机，对改善预后有重要意义。目前，卵巢癌易感基因检测主要依据卵巢癌家族史和基因多态性诊断试验。基因多态性诊断实验主要围绕MTHFR、GSTTl、CYPlBl基因进行。MTHFR是叶酸代谢关键酶，催化5，10-亚甲基四氢叶酸不可逆的转变成5_甲基四氢叶酸，后者作为叶酸在血浆和组织中存在的主要形式参与同型半胱氨酸转化为S-腺苷甲硫氨酸的过程，而S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，在机体代谢、DNA甲基化和核酸合成过程中起重要作用。研究发现MTHFR基因上C677T多态性位点突变可以导致酶的热稳定性和酶活性的下降，从而引起DNA甲基化出现异常，这种甲基化异常可能导致癌基因和抑癌基因表达异常，影响对细胞生长和功能的调控，促进癌症的发生。研究表明，MTHFR基因C677T 多态性与卵巢癌的发生密切相关。谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)属于II相代谢酶，能促进各种亲电子的化合物(包括环境致癌物及其中间代谢产物)与谷胱甘肽结合，形成易溶于水的化合物排除体外，是与毒物或致癌物的解毒代谢有关的酶类，已知人类GSTs家族中GSTMl和GSTTl与肿瘤发生的关系比较密切。GSTTl具有present和null两个等位基因，其中present具有正常的酶活性，而null基因是指结构基因缺失的纯合子，又称为空白基因型，缺乏GSTTl酶活性。正常的GSTTl酶活性可能通过促进致癌剂的亲电作用及从体内的排除而保护易感组织，防止体细胞的DNA突变，而GSTTl基因的纯和缺失可能会降低或丧失机体代谢及排出致癌物的功能，从而具有较大的肿瘤危险性。因此可以将GSTTl基因的缺失基因型作为卵巢癌发生的危险因素之一。综上所述，鉴于MTHFR、GSTTl、CYPlBl在卵巢癌变过程中有着不可忽视的作用，可以将上述基因作为遗传易感因素来检测出女性在卵巢癌发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患卵巢癌的女性高危人群，从而有针对性的预防和治疗卵巢癌，这对于降低女性卵巢癌的发病率有非常重要的意义。
技术实现思路
基于MTHFR 基因上 C677T，GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，CYPlBl 基因上Leu432Val的3个单核苷酸多态性位点基因型可作为评估卵巢癌发病的危险因子的基础上，本专利技术提供一种卵巢癌易感基因检测试剂盒。该试剂盒包括检测MTHFR 基因上 C677T，GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，CYPlBl 基因上 Leu432Val的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)； PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本专利技术试剂盒的组分和含量包括PCR 反应体系10 X PCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ；20uM特异性引物对(每条引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 产物纯化体系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0. 375ul ； ddH203. 875uL·测序反应体系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 测序引物 Iul ； 125mMEDTA 溶液 Iul ； 100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本专利技术中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1.检测试剂盒的使用1、抽提DNA模板刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。2、PCR扩增反应使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对(1)MTHFR(C677T)正向引物5' CATCCCTCGCCTTGAACAG3‘ MTHFR(C677T)反向引物5 ‘ CAGACACTGTTGCTGGGTTTT3‘(WGSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3‘ GSTTl (Nu 11/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3‘(3) CYPlBl (Leu432Val)正向引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3 ‘ CYPlBl (Leu4 32Val)反向引物5 ‘ AGCCAGGATGGAGATGAAGAG3 ‘PCR扩增的反应体系为10 X PCR反应缓冲液2. 5μ 1 ； 25mM的dNTP混合液0. 2 μ 1、 5U/ul Taq酶0. 125 μ 1、DNA模板 1 μ 1 (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 0. 25 μ 1、 ddH20 19. 175μ 1 ；反应条件为94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C 1 分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。3、PCR扩增产物纯化使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物 20ul, lU/ul SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去离子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。4、DNA测序反应使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物(1)MTHFR(C677T)测序引物5' CATCCCTCGCCTTGAACAG3‘(2)GSTTl (Null/Present)测序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3‘(3)CYPlBl(Leu432Val)测序引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3‘反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测卵巢癌易感基因无创检测试剂盒，其特征在于检测MTHFR基因上C677T， GSTTl基因是否缺失(Null/Present) ,CYPlBl基因上Leu432Val的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、 BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对MTHFR 基因上C677T，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，CYPlBl基因上Leu432Val的3个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这3个SNPs位点的DNA片段的引物对。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的DNA测序引物是针对MTHFR基因上C677T，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，CYPlBl基因上Leu432Val的3个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述3个SNPs位点基因型的DNA 测序引物。4.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于，所含的3对特异性引物序列如下(1)MTHFR(C677T)正向引物5‘CATCCCTCGCCTTGAACAG3‘MTHFR(C677T)反向引物5, CAGACACTGTTGCTGGGTTTT3‘(2)GSTTl(Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3‘GSTTl (Null/Present)反...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘加奎，姜丽，
申请(专利权)人：解码上海生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。