本发明专利技术公开了一种pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-HCN4质粒的构建方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：（1）从心肌组织中提取总RNA，将提取的总RNA反转录合成cDNA第一链，以反转录得到的cDNA为模板，使用含有核苷酸序列为SEQNo：2和为SEQNo：3的基因特异性引物通过PCR扩增得到HCN4起搏基因；（2）抽提pCDH1-MCS1-EF1-copGFP质粒，分别对空质粒载体pCDH1-MCS1-EF1-copGFP和步骤（1）PCR扩增得到的HCN4起搏基因用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切；（3）将双酶切后的空质粒载体pCDH1-MCS1-EF1-copGFP和双酶切后的HCN4起搏基因进行连接反应，将HCN4起搏基因连接入pCDH1-MCS1-EF1-copGFP质粒中，构建形成pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-HCN4质粒。该质粒可以作为生物起搏的研究基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物起搏
，具体涉及一种P⑶Hl-MCSl-EFl-copGFP-HCN4质粒及其构建方法。
技术介绍
哺乳动物基因组编码四种HCN基因，分别命名为HCNl HCN4。这四种异构体在心脏中均已发现，但不同种属、不同心脏组织和发育不同阶段这些异构体的表达存在差异不同种属成年动物窦房结均优势表达HCN4，约占窦房结总体HCN的80%。在四种异构体中HCN1，2，4是心脏中的主要部分，HCN3只在胚胎起搏细胞中有低水平表达。起搏活性小的区域(如心室肌)，HCN2的表达占优势；而起搏活性高的区域HCN4的表达占优势。目前对于生物起搏的研究集中于HCN2和HCN4，也就是把起搏基因HCN1-4转到干细胞中，增加起搏细胞的起搏电流(If)来治疗慢性心律失常。而构建起搏通道基因亚型 pCDHl-MCSl-EFl-copGFP-HCN4质粒是研究HCN4基因、起搏电流的特性以及研究生物起搏的前提和基础。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种ρ⑶Hl-MCSl-EFl-copGFP-HCN4质粒的构建方法，使 pCDHl-MCSl-EFl-copGFP-HCN4质粒中带有HCN4基因，可以作为生物起搏研究的基础，也可以作为慢性心律失常的细胞治疗和基因治疗的基础。为了解决现有技术中的这些问题，本专利技术提供的技术方案是一种ρ⑶Hl-MCSl-EFl-copGFP-HCN4质粒的构建方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)从心肌组织中提取总RNA，将提取的总RNA反转录合成cDNA第一链，以反转录得到的cDNA为模板，使用含有核苷酸序列为SEQ No :2和为SEQ No :3的基因特异性引物通过PCR扩增得到HCN4起搏基因；(2)抽提pCDHl-MCSl-EFl-copGFP质粒，分别对空质粒载体 pCDHl-MCSl-EFl-copGFP和步骤(I)PCR扩增得到的HCN4起搏基因用EcoR I和BamH I进行双酶切(3)将双酶切后的空质粒载体ρ⑶Hl-MCSl-EFl-copGFP和双酶切后的HCN4起搏基因进行连接反应，将HCN4起搏基因连接入ρ⑶Hl-MCSl-EFl-copGFP质粒中，构建形成 pCDHl-MCSl-EFl-copGFP-HCN4 质粒。优选的，所述方法步骤(1)中从心肌组织中提取总RNA采用的提取试剂为Trizol 试齐LU优选的，所述方法步骤(1)中提取的总RNA反转录合成cDNA第一链时先进行退火使RNA变性，然后在具有反转录酶的条件进行合成cDNA第一链。优选的，所述方法步骤⑴中进行PCR扩增的PCR反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl2, TaqDNA聚合酶、模板DNA的，所述PCR反应体系终浓度组成为PCR缓冲液终浓度1 IOX ；dNTPs0.01 1.5mM;基因特异性引物 终浓度为0. 01 2 ii M ；模板 cDNA0. 01 IOng/ U L ；KOD plus 酶0. 01 1. OU/ii L ；MgSO4终浓度为 0.5 5mM。优选的，所述方法步骤⑴中进行PCR扩增的条件为92 97°C预变性4 15min ； 92 97°C变性10 30s，56 60°C退火10 30s，65 75°C延伸10 30s，共30 40 个循环。优选的，所述方法步骤O)中采用碱裂解法小量抽提p⑶Hl-MCSl-EFl-copGFP质粒。优选的，所述方法步骤O)中进行酶切的条件是温度控制在32 38°C，酶切1 3小时。优选的，所述方法步骤(3)中进行连接反应的条件是温度控制在20 25°C，连接 反应进行1 3小吋。本专利技术通过p⑶Hl-MCSl-EFl-copGFP基础质粒作为表达载体与克隆 HCN4基因(HCN4基因的序列SEQ No 1)的cDNA结合构建成起搏通道基因亚型 pCDHl-MCSl-EFl-copGFP-HCN4 质粒。该质粒可以作为穿梭质粒与慢病毒系统重组后的慢病毒载体包装质粒共转染 HEK293細胞，获得病毒液；对病毒液进行病毒滴度測定，并进行浓缩和纯化得到高质量的 病毒液。可以通过感染宿主细胞对病毒液中的HCN4重组慢病毒载体进行了鉴定。这种慢病毒既可以感染分裂細胞又可以感染非分裂細胞；其病毒基因组可以整合 于宿主基因组中，长时间、稳定表达外源基因并具有较低的免疫原性。把带有起搏基因HCN4 的片段重组到慢病毒中，进而再转到干細胞中，以增加起搏细胞的起搏电流(If)来治疗慢 性心律失常。因此，构建起搏通道基因亚型HCN重组慢病毒载体是研究HCN基因、起搏电流 的特性以及生物起搏等的前提和基础。关于p⑶Hl-MCSl-EFl-copGFP-HCM质粒转染慢病 毒形成起搏通道基因亚型HCN重组慢病毒载体可以參考申请人的另ー专利申请文件——申 请号为200710190402. 2的名称为起搏通道基因亚型HCN4重组慢病毒载体的构建方法的中 国专利申请，该文献中pCDHl-GFP-HCM即为本专利技术pCDHl-MCSl-EFl-copGFP-HCN4质粒。在本专利技术中，术语“引物”是指ー种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以 作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在上述条件下可以诱发合成与核酸链相互补的 引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核酸及ー种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆 转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液并在合适的温度下进行上述合成。优选的引物是单 股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但在一般在15 25个核 苷酸之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板形成充分稳定的杂交复合物。 引物不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂交并引发DNA合成。引物设计遵循原则①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产物不 能形成ニ级结构。③引物长度一般在15 30碱基之间。④G+C含量在40% 60%之间。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧引物5'端可以修饰。⑨引物3'端不可修饰。⑩引物3'端要避开密码子的第3位。进行引物设计的软件有I^rimer 5，Beacon Designer 7。引物合成采用的方法为亚磷酰胺三酯法，将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3' -5' 磷酸二酯键连接。具体步骤包括1、将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基。2、合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3 ‘ 端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。3、带帽 (capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2% )，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。4、在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周亚峰，杨向军，李红霞，韩莲花，蒋文平，
申请(专利权)人：苏州大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。