本发明专利技术公开了一种自噬串联荧光探针mTagRFP-mWasabi-LC3及其应用。本发明专利技术提供了一种用于检测细胞自噬的融合蛋白，由红色荧光蛋白mTagRFP、绿色荧光蛋白mWasabi和自噬标记蛋白LC3组成；所述红色荧光蛋白mTagRFP、所述绿色荧光蛋白mWasabi均位于所述自噬标记蛋白LC3的氨基端。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术提供的mTagRFP-mWasabi-LC3，对荧光蛋白标签进行了关键性的改良。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种自噬串联荧光探针 mTagRFP-mffasabi-LC3 及其应用。
技术介绍
研究自噬及其复杂的分子诱导机制，探索自噬在肿瘤发生、发展中发挥的作用，是利用细胞自噬为疾病治疗，如恶性肿瘤治疗提供新途径的基础。通过调节自噬活性治疗已经成为当代肿瘤治疗和帕金森等神经性疾病治疗领域的一个新靶点和研究热点。因此，无论是科研单位还是制药公司对药物诱导的自噬在疾病治疗中的应用表示出极大的兴趣，希望通过研究自噬和死亡的关系和分子机制，进而利用自噬的调节作用，使其疾病治疗中发挥作用。目前，观察自噬的方法有很多种。电镜是检测自噬体，判断自噬发生的金标准。但是由于其样品制备过程繁琐，电镜操作技术要求高，只能通过观察某一个时间段的细胞切片中自噬体，并且电镜下的这些结构很容易混淆，如吞噬泡和自噬泡，溶酶体和自噬溶酶体泡。因此，需要一个能在活细胞内实时动态的观察自噬泡的形成和变化，进一步观察细胞内自噬流的变化，这对在判断细胞内自噬是否被激活的研究中展示出其极大的优势。利用细胞内转染荧光蛋白与LC3融合表达的质粒作为自噬探针，动态观察自噬发生和发展的技术已经成为目前最简便并有效的检测方法，目前广为应用的标签分子包括 RFP-LC3, GFP-LC3, CFP-LC3，YFP-LC3，RFP1-EGFP-LC3，mCherry-EGFP_LC3。在这些方法中，RFP1-EGFP-LC3及其改良的mCherry-EGFP_LC3均是利用红色与绿色两种荧光蛋白的发光团对酸的耐受性差异，进而观察自噬流的变化。当自噬体与溶酶体融合后，由于RFPl/ mCherry荧光的耐酸性强而EGFP不耐酸的特点，自噬溶酶体中只能观察到红色荧光。随着荧光蛋白标记技术的不断发展，RFP1-EGFP-LC3及mCherry-EGFP_LC3探针在研究自噬中表现出了其自身的局限性。RFP1-EGFP-LC3及mCherry-EGFP-LC3探针的主要原理是根据荧光蛋白的耐酸性差异对自噬流进行观测。mCherry-EGFP-LC3中将mCherry取替 RFPl仅仅是对红色荧光蛋白的性能进行了简单的改良。而随着荧光蛋白的发展和对EGFP 进一步的研究发现，EGFP的荧光在酸性环境下并不会迅速消失，这使得该方法在检测自噬体与溶酶体融合过程中容易出现误差。而EGFP-LC3与Lamp-RFP共转染4 后，EGFP-LC3趋向聚集与溶酶体的位置，并且EGFP在溶酶体中仍具有荧光。这使得统计自噬体和自噬溶酶体的数量，判断自噬活性上容易造成误差。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于检测细胞自噬的融合蛋白。本专利技术提供的融合蛋白，包括红色荧光蛋白mTagRFP、绿色荧光蛋白mWasabi和自噬标记蛋白LC3 ；所述红色荧光蛋白mTagRFP、所述绿色荧光蛋白mWasabi均位于所述自噬4标记蛋白LC3的氨基端。在上述融合蛋白中，所述mTagRFP蛋白、所述mWasabi蛋白和所述自噬标记蛋白 LC3顺次连接；其中，mTagRFP的氨基酸序列为序列表中的序列2的自5’末端第1_231位氨基酸；其中，mWasabi的氨基酸序列为序列表中的序列2的自5’末端第235-470位氨基酸；其中，自噬标记蛋白LC3的氨基酸序列为序列表中的序列2的自5’末端第 475-615位氨基酸。上述的融合蛋白为如下1)或2)的蛋白1)序列表中的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白；2)将序列2的氨基酸序列经过几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白；上述融合蛋白中，所述几个氨基酸残基的取代、缺失或添加为不超过10个的氨基酸残基的取代、缺失或添加。上述融合蛋白的编码基因也是本专利技术保护的范围。上述融合蛋白的编码基因是下述1)-3)中任一所述基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)与1)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白所示的 DNA分子；3)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的且编码具有相同功能的蛋白所示的 DNA分子。在上述编码基因中，所述严格条件所述严格条件为在6XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC,0. 1% SDS和1XSSC，0. 1% SDS各洗膜一次。含有上述融合蛋白的编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也是本专利技术保护的范围。上述重组载体具体为将所述融合蛋白的编码基因插入表达载体pcDNA3. 1(+)的 EcoRI和^CbaI位点间，得到表达所述融合蛋白的载体。上述转基因细胞系为将所述的重组表达载体转入宿主细胞得到的细胞系，在本专利技术的实施例中，宿主细胞具体为Hela细胞系。上述重组载体、上述融合蛋白或上述融合蛋白编码基因在制备检测细胞自噬荧光探针中的应用也是本专利技术保护的范围；上述重组载体、上述融合蛋白或上述融合蛋白编码基因或上述转基因细胞系在检测细胞自噬流和/或自噬溶酶体中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术的还可以提供一种检测或辅助检测待测细胞自噬流和/或自噬溶酶体的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤1)将所述的重组载体转入待测细胞中，得到转基因细胞系；2)检测步骤1)得到的转基因细胞系的荧光发光情况，若转基因细胞系的荧光发光情况，随着自噬的发生，若所述转基因细胞系中红色荧光斑点多于绿色荧光斑点，则所述待测细胞形成或候选形成自噬流(完整自噬流)或产生或候选产生自噬溶酶体(既诱导了自噬，并且具有完整的自噬流，即自噬体最终溶酶体融合，进一步降解内容物)，若所述转基因细胞系中红色荧光斑点等于绿色荧光斑点，则所述待测细胞抑制或候选抑制自噬流形成或不产生或候选不产生自噬溶酶体。在上述方法中的步骤2、中，所述红色荧光荧光斑点多于绿色荧光斑点体现在两种荧光叠加图中仅有红色荧光没有绿色荧光；在上述方法中的步骤2、中，所述红色荧光斑点等于绿色荧光斑点数体现在两种荧光叠加图中没有红色荧光，仅有红色和绿色的叠加的黄色。上述方法中，所述转基因细胞系经过加入EBSS，Z18或者CQ处理。上述判断方法也可以为若在荧光显微镜的叠加照片中红色荧光聚集点比绿色荧光聚集点并不完全重叠，红色荧光聚集点逐渐增加，则所述待测细胞在诱导自噬过程中具有完整的自噬流，若在荧光显微镜的叠加照片中红色和绿色荧光聚集的点能重叠在一起， 则所述待测细胞的自噬流被抑制。在步骤1)和步骤2)之间还包括如下步骤将步骤1)得到的转基因细胞系经自噬诱导剂诱导的步骤，所述自噬诱导剂为EBSS或Z18。自噬流细胞发生自噬，形成双层膜的自噬体，包裹细胞内部分的胞质和细胞内需要降解的细胞器、蛋白质等，并最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其包裹的内容物的过程，此过程为完整的自噬流。如图3所示。上述方法中，检测具体为通过激光共聚焦荧光显微镜进行。本专利技术的实验证明，本专利技术提供的mTagRFP-mWasabi-LC3，对荧光蛋白标签进行了关键性的改良。mTagRFP相比RFPl而言，荧光亮度更亮，光学特性更好，更耐酸。mWasabi对酸非常敏感，在溶酶体所在的位置无mWasabi的荧光。同时，构建 mTagRFP-mffasabi-LC3 Δ G，作为其对照。该方法在监测自噬的过程中，具有更加灵敏和准确本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林坚，夏斌，周翠红，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。