脑膜炎球菌fHBP多肽制造技术

fHBP是脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria?meningitidis)的一种蛋白质。已知fHBP有三个家族。为增强fHBP蛋白引发家族间交叉反应性抗体的能力，对fHBP进行选择和工程改造，使其具有的序列在给予宿主动物后可引发广谱杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于免疫领域，具体地说，属于对奈瑟球菌属致病菌，如脑膜炎奈瑟球菌 (N. meningitidis)所导致疾病的免疫。
技术介绍
脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是一种革兰阴性荚膜菌，其寄居于约 10%人群的上呼吸道中。虽然已有针对血清群(serogroupM、C、W135和Y的多糖和偶联疫苗，但是该方法不能用于血清群B，因为其荚膜多糖多聚唾液酸聚合物是人类的一种自身抗原。为了开发针对血清群B的疫苗，业已采用了其外膜囊泡(OMV)中所含的表面暴露蛋白质。这些疫苗可以引发血清杀菌抗体应答并保护机体抵抗疾病，但不能诱导菌株间交叉保护力。于是一些研究者将注意力集中到脑膜炎球菌特异性抗原在疫苗中的用途。 一种这样的抗原是脑膜炎球菌H因子结合蛋白(fHBP)，也称为“741”蛋白，“NMB1870”、“GNA1870”，“P2086”、“LP2086”或“0RF2086” 。该脂蛋白在所有的脑膜炎球菌血清群中均有表达，已发现其存在于多种脑膜炎球菌菌株中。fHBP序列可分为三个家族(本文中称为家族I、II和III)，已发现抗某给定家族的血清对同一家族菌株具有杀菌作用，但对表达其它两个家族之一的菌株无活性，即在家族内有交叉保护作用，而家族间无交叉保护作用。因此，为了用fHBP来获得菌株间交叉保护作用，采用了一个以上的家族。为了避免表达和纯化各自蛋白质的需要，已提议将不同的家族蛋白质表达为杂合蛋白质， 将两个或三个家族包括在单个多肽链中。参考文献13和14描述了多种基于突变修饰fHBP 序列的方法，以增强其对家族I、II和III之间的覆盖度。本专利技术的目的之一是为克服fHBP所赋予保护作用的家族特异性提供进一步的改进方法，以及用这些方法提供对脑膜炎球菌疾病和/或感染，特别是对血清群B的免疫力。
技术实现思路
菌株MC58的全长fHBP具有以下氨基酸序列(SEQ ID N0:1)MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI⑶IAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ成熟的该脂蛋白缺少SEQ ID NO 1的前19个氨基酸，fHBP的AG形式缺少前沈个氨基酸。MC58序列(SEQ ID NO 1)属于fHBP家族I。采用MC58序列引发的抗体对MC58 菌株有高杀菌活性，但对表达家族II或III fHBP菌株的活性则低得多。在一些实施方式中，本专利技术涉及fHBP的修饰形式，其中的修饰作用增强了该蛋白引发家族间交叉杀菌抗体的能力。在其它实施方式中，本专利技术涉及能天然引发家族间交叉杀菌抗体的fHBP形式。因此本专利技术提供了一种多肽，其包含一段选自以下SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76和77的氨基酸序列。这些氨基酸序列起始于与MC58序列Val27匹配的残基，但在下游位点包含各种氨基酸修饰。两个优选的序列是SEQ ID NO 20和23。也优选SEQ ID NO :76。所述多肽给予宿主动物后具有诱导杀菌性抗脑膜炎球菌抗体的能力，在优选的实施方式中，可以诱导对fHBP I-III三个家族各自菌株的杀菌性抗体。关于杀菌应答的其它信息在下文中给出。本专利技术也提供了一种多肽，包含一段与SEQ ID NO :76具有至少相同性的氨基酸序列。k 值可选自 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或更高。本专利技术也提供了一种多肽，包含含有SEQ ID NO :76的第一片段和第二片段的氨基酸序列，其中所述第一片段包括SEQ ID N0:76第89-1M位氨基酸形成的一个表位，所述第二片段包括SEQ ID NO :76第187-248位氨基酸形成的一个表位。通常该第一和第二片段独立地长至少 7 个氨基酸，例如，8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、沘、30、32、24、洸、28、40、45、50、55、60个氨基酸或更多。本专利技术也提供了一种多肽，包含以下氨基酸序列(i)与SEQ ID N0:76具有至少相同性和(ii)包含所述SEQ ID NO :76的第一和第二片段。本专利技术还提供了一种多肽，包含氨基酸序列SEQ ID NO:取代可发生在SEQ ID NO 2相应位置的氨基酸。所述多肽可以引发能与SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2 二者结合的抗体。本专利技术还提供了一种多肽，包含氨基酸序列SEQ ID NO:取代可以发生在SEQ ID NO :2相应位置的氨基酸。所述多肽可引发能与SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2 二者结合的抗体。本专利技术还提供了一种多肽，包含氨基酸序列SEQ ID NO:取代可发生在SEQ ID NO 2相应位置的氨基酸。所述多肽可引发能与SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2 二者结合的抗体。多月太可以通过各种方法制备本专利技术的多肽，例如，(至少部分)化学合成、用蛋白酶消化较长多肽、翻译RNA、纯化细胞培养物(例如，重组表达或脑膜炎奈瑟球菌培养物)等。在大肠杆菌(宿主中异源表达是一种优选的表达途径。fHBP是脑膜炎奈瑟球菌的天然脂蛋白。已发现其在大肠杆菌中表达时被脂化并带有天然的前导序列。本专利技术的多肽可含有可被脂化的N末端半胱氨酸残基，例如，可含棕榈酰基团，通常会形成三棕榈酰-S-甘油-半胱氨酸。在其它实施方式中，所述多肽不被脂化。本专利技术优选多肽的一个特征是给予宿主动物后具有诱导杀菌性抗脑膜炎球菌抗体的能力。制备的多肽优选为基本纯或基本分离的形式(即基本上不含奈瑟球菌或宿主细胞的其它多肽)或基本分离的形式。一般来说，在非天然产生环境中提供所述多肽，例如，将其与天然产生的环境分离。在某些实施方式中，与对照相比本专利技术多肽存在于富含所述多肽的组合物中。如此提供纯化多肽，其中纯化指所述多肽存在于基本上不含其它表达多肽的组合物中，基本上不含指组成所述组合物的其它表达多肽少于90%、通常少于60%、 更通常少于50%。多肽可有各种形式(例如，天然、融合、糖基化、非糖基化、脂化、二硫桥等)。SEQ ID NO 4_76不包括N末端甲硫氨酸。如果通过在宿主生物中翻译产生本专利技术的多肽，需要起始密码子，在大多数宿主中需提供N末端甲硫氨酸。因此本专利技术多肽至少在新生阶段包含位本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　２０、２３、７６、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４和７５。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·皮扎，M·斯卡塞利，M·M·朱利亚尼，M·阿科，R·拉普奥里，
申请(专利权)人：诺华有限公司，
类型：发明
国别省市：CH