在天然情况下，脑膜炎球菌fhbp基因(编码H因子结合蛋白)在两种差异调控的启动子控制下，由两种独立转录物表达。在一个转录物中，它与相邻上游基因由Pnmb1869启动子共同表达。另一转录物是单顺反子，由其自身专用启动子Pfhbp表达，该表达由全局调控蛋白FNR应氧气限制条件而激活。为了提高单顺反子转录物的表达，采用组成型活性FNR突变体。因此可激活Pfhbp启动子，导致FNR-激活基因如fhbp的过度表达。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及蛋白质表达领域，具体涉及奈瑟球菌H因子结合蛋白(fHBP)的表达。
技术介绍
脑膜炎奈瑟球菌是革兰阴性的有荚膜细菌病原体。在开发对抗血清组B脑膜炎球菌的广谱疫苗中一种感兴趣的抗原是fHBP，也称为蛋白质‘741’ [I]、‘NMB1870’、‘GNA1870’ [2-4]、‘P2086’、‘LP2086’ 或‘0RF2086’ [5-7] 这种脂蛋白在所有脑膜炎球菌血清组中表达，并在多种菌株中发现。已将fHBP序列分为三个家族[2](在本文中称为家族1、11和III)，又给定家族产生的血清对同一家族产生杀细菌活性，但对表达其它家族之一的菌株无活性，即存在家族内、而非家族间交叉保护。对于疫苗接种目的，fHBP蛋白已用作大肠杆菌(E. coll)中表达的重组蛋白[8]或已经在脑膜炎球菌中过度表达，以至于从过度表达菌株中纯化的外膜囊泡将展示大量免疫原性fHBP[9]。然后，这些囊泡可用于疫苗，以提供強大的保护性抗-fHBP应答。本专利技术的ー个目的是提供提高脑膜炎球菌中fHBP表达的额外的改良方法。
技术实现思路
本专利技术人发现，fhbp基因由两种差异调控的启动子从两种独立转录物表达。在一个转录物中，它与相邻上游基因(nmbl869)由Pnmbl869启动子共同表达。另ー转录物是单顺反子，并由其自身专用启动子Pfhbp表达，它由全局调控蛋白FNR(已知的厌氧激活物蛋白质、延胡索酸和硝酸还原酶调节物)因氧限制条件而激活。为了提高单顺反子转录物的表达，采用FNR的突变形式。该突变形式是组成型活化的，甚至在有氧条件下也是如此，因此内源性Pfhbp启动子组成型激活，导致fHBP过度表达。可采用相同方法过度表达任何其它具有FNR激活的启动子的脑膜炎球菌基因，包括经工程改造处于这种启动子控制下的基因。因此，本专利技术提供一种脑膜炎球菌，其(a)具有其转录处于FNR激活的启动子控制下的基因，和(b)表达FNR的组成型活性形式。FNR的表达导致FNR活化基因的组成型表达。转录处于FNR激活的启动子控制下的基因最好是fhbp基因。虽然不是必需，但脑膜炎球菌最好不表达FNR的非组成型活性形式。本专利技术也提供一种制备脑膜炎球菌突变体的方法，该方法包括修饰其内源性fnr基因的步骤，以使编码的FNR蛋白组成型活化。本专利技术也提供一种制备脑膜炎球菌突变体的方法，该方法包括引入编码FNR的组成型活性形式的基因的步骤。该方法也可包括修饰脑膜炎球菌中任何内源性fnr基因的步骤以抑制或防止其表达。因此，本专利技术还提供一种提高转录物表达的方法，该转录物在脑膜炎球菌中的转、录受FNR激活的启动子控制，该方法包括为脑膜炎球菌提供FNR的组成型活性形式。然后，转录物表达增加可提高脑膜炎球菌中编码蛋白的水平。因此，本专利技术还提供一种在脑膜炎球菌中提高转录物表达的方法，该转录物含有其表达受至少两个不同启动子控制的基因，这两个启动子中ー个是FNR激活的启动子，另一个不是，所述方法包括向所述脑膜炎球菌提供FNR的组成型活性形式，从而提高该转录物的表达。在包含该基因的多种转录物中，相对于不同启动子驱动的转录物，FNR活化启动子驱动的转录物增加。本专利技术还提供一种制备脂蛋白体脑膜炎球菌囊泡的方法，该方法包括处理本专利技术脑膜炎球菌的步骤，以破坏其外膜，从而由其形成包含外膜的蛋白质组分(如fHBP)的囊泡。所述囊泡可用作免疫原性组合物中的免疫原性组分(例如，作为对抗脑膜炎球菌的疫苗)。该方法可包括从任何活的和/或完整的细菌分离囊泡的又ー步骤，例如，通过大小分离(如过滤，使用允许囊泡通过但不允许完整细菌通过的滤器)，或通过离心以使细胞相对于囊泡优先沉淀(例如低速离心)。 本专利技术还提供一种制备免疫原性组合物(如疫苗)的方法，该方法包括将由上述囊泡制备方法制备的囊泡与药学上可接受的运载体(如缓冲液)和/或免疫佐剂和/或一种或多种其它免疫原性组分配制在一起的步骤。本专利技术还提供表达FNR的组成型活性形式的脑膜炎球菌。本专利技术还提供脑膜炎球菌FNR的组成型活性形式，此外还提供编码这一 FNR的核酸。特别有用的FNR的组成型活性形式包含SEQ ID NO :5，与野生型FNR序列(来自菌株MC58的SEQ ID NO :4)相比该序列在Asp-148上有突变，如D148A，其中野生型Asp 148被Ala代替。与现有策略相比，本专利技术提供在脑膜炎球菌中过度表达外膜蛋白(如fHBP)的优势。虽然已提示通过异源启动子驱动表达以过度表达蛋白质，但这些策略只有在异源启动子的基础活性高于内源性启动子时才导致过度表达。本文所述的策略通过增加或提高FNR活化基因的内源表达直接作用，在无需启动子修饰的条件下实现过度表达。脑膜炎球菌本专利技术提供各种脑膜炎球菌，其表达组成型活性FNR。因此，与正常的野生型菌株不同，FNR活化基因可高水平表达，即使在不限制氧水平吋。这类基因包括fhbp基因，因此本专利技术脑膜炎球菌可在其外膜中过度表达fHBP蛋白。本专利技术的脑膜炎球菌可由野生型菌株通过定点诱变制备，或者通过随机诱变后筛选所需修饰制备，或者通过敲除和敲入技术制备。例如，可利用定位诱变技术修饰编码内源性FNR的基因，以引入提供组成型活性的突变。在其它实施方式中，可敲除内源性fnr基因(例如，通过缺失或用标记物替换)，并可引入新的fnr基因(例如位于与缺失相同的位点上、整合到染色体上但位于不同于缺失的位点上，或在质粒上)。在其它实施方式中，引入新的fnr基因而保持内源性fnr基因。实现这些和相似目标的各种方式是显而易见的。基因NMB1428和NMB1429之间的整合是方便的。与正常野生型菌株相比，本专利技术脑膜炎球菌表达组成型活性FNR。除此种修饰之夕卜，脑膜炎球菌与野生型菌株相比还可具有至少ー种其它修饰，例如通过遗传操作引入的修饰[10-13]。例如，可修饰脑膜炎球菌以提高免疫原性(例如，以高表达免疫原，包括FNR未激活的免疫原)，以降低毒性、抑制荚膜多糖合成、下调PorA表达等。本专利技术脑膜炎球菌可具有修饰的fur基因[14]。參考文献21教导，应当通过伴随的porA和cps的敲除上调nspA的表达,可以使用这些修饰。脑膜炎球菌可表达多种不同的PorA亚型[15]。本专利技术脑膜炎球菌可具有低内毒素水平，例如通过敲除參与LPS生物合成的酶实现[16，17]。这些或其它突变体均可以与本专利技术一起使用。本专利技术脑膜炎球菌可表达ー种以上PorA亚型。之前已构建出6价和9价PorA菌株。菌株可表达 2、3、4、5、6、7、8 或 9 种 PorA 亚型P1. 7,16 ；P1. 5-1,2-2 ；P1. 19,15-1 ；PL 5-2，10 ；P1. 12-1. 13 ；P1. 7-2,4 ；P1. 22，14 ；P1. 7-1,1 和/或 PL 18_1，3，6。在其它实施方式中，可以下调菌株中PorA的表达，例如，PorA的量相对于野生型水平(例如相对于H44/76菌株)减少了至少20% (例如，彡30%、彡40%、彡50%、彡60%、彡70%、彡80%、彡90%、彡95%等)，或甚至被敲除。本专利技术脑膜炎球菌可以高表达(相对于相应的野生型菌株)某些蛋白质。例如， 菌株可以高表达NspA、蛋白287 [18]、TbpA和/或Tbp本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.09.30 US 61/247,4281.一种脑膜炎球菌，其(a)具有其转录处于FNR激活的启动子控制下的基因，和(b)表达FNR的组成型活化形式。2.如权利要求I所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述转录在FNR激活的启动子控制下的基因是fhbp。3.一种制备脑膜炎球菌突变体的方法，包括(a)修饰其内源性fnr基因，以使编码的FNR蛋白组成型活化，或(b)引入编码FNR的组成型活性形式的基因的步骤。4.一种制备脂蛋白体脑膜炎球菌囊泡的方法，该方法包括处理权利要求I或2所述的或可通过权利要求3所述方法获得的脑膜炎球菌的步骤，以破坏其外膜，从而由其形成包含外膜的蛋白质组分的囊泡。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述脂蛋白体脑膜炎球菌囊泡包含fHBP。6.如权利要求4或5所述的方法，其还包括从任何活的...
【专利技术属性】
技术研发人员：F·奥里恩特，I·德莱尼，
申请(专利权)人：诺华有限公司，
类型：发明
国别省市：
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