脑膜炎球菌NMB1870的嵌合型、杂交和串联多肽制造技术

NMB1870是脑膜炎奈瑟球菌的一种蛋白质。已知NMB1870有三个家族。为增强NMB1870蛋白质引发在家族之间有交叉反应性的抗体的能力，工程改造了NMB1870。可用一个NMB1870家族的序列取代另一家族的相应位置。不同家族的NMB1870蛋白质序列可彼此相连。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫接种,特别是免疫接种抵御奈瑟球菌(Neisseria)属，例如脑膜炎奈瑟球菌(N. meningitidis)(脑膜炎球菌)病原菌所致疾病的领域。
技术介绍
脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是荚膜革兰氏阴性细菌,其寄居在约10%人群的上呼吸道中。虽然已有抗血清群A、C、W135和Y的多糖和偶联物疫苗，但该方法 不能应用于血清群B，因为其荚膜多糖是聚唾液酸的聚合物，是一种人体自身抗原。现已利用外膜囊泡(OMV)中所含的表面暴露蛋白来开发抗血清群B的疫苗。这些疫苗能引发血清杀细菌抗体应答并提供保护以抵御疾病，但它们不能诱导交叉菌株保护作用。因此，一些研究人员将注意力集中在疫苗所用的特定脑膜炎球菌抗原上。一种这样的抗原是“NMB1870”。该蛋白质最初披露为菌株MC58的蛋白质“741”，也称为“GNA1870”和“0RF2086”。该脂蛋白在所有脑膜炎球菌血清群中表达，也见于多种脑膜炎球菌菌株中。NMB1870序列分成三个家族(在本文中称为家族1、11和III)，发现针对某给定家族的抗血清在同一家族中具有杀菌活性，但对于表达其它两家族之一的菌株无此活性，即具有家族内交叉保护作用，但不具有家族间保护作用。因此，为利用NMB1870实现交叉菌株保护作用，利用了多个家族的此蛋白。有人提出可将不同家族蛋白表达成杂交蛋白，包括将两种或三种所述家族中的此蛋白表达在一条多肽链中，从而无需分别表达和纯化蛋白质。检验了几种杂交体，得到令人鼓舞的抗脑膜炎球菌效力。本专利技术的目的之一是提供其它改进方法来克服NMB1870所致保护作用的家族特异性，并利用这些方法来提供抵御脑膜炎球菌疾病和/或感染，特别是血清群B的免疫力。
技术实现思路
作为补充参考文献13所述的工作，本专利技术人用一个家族的NMB1870序列取代入另一家族的相应位置，其目的是产生不具有野生型多肽的家族特异性的嵌合型NMB1870。除了工程改造一种NMB1870使之具有所有三个家族的特征，本专利技术人还制备了包含多个家族的NMB1870序列的新杂交多肽和串联多肽，从而补充了参考文献10和12所述的工作。虽然各家族的NMB1870多肽能引发仅对同一 NMB1870家族内的菌株有效的抗体(例如，在小鼠中)，但本专利技术的嵌合型杂交和串联多肽能引发识别多个家族的NMB1870多肽的抗体。本专利技术还鉴定了 NMB1870的各种新的多态性形式，包括与以前报道的三种家族不同的序列(家族IV)。 NMB1870 家族取代参考文献13披露了将一个NMB1870家族的序列取代入另一 NMB1870框架中，从而产生了嵌合型NMB1870多肽。本专利技术人对杂交体实施了进一步研究，鉴定到在家族INMB1870序列中进行取代的许多关键残基。这些残基的取代可以提闻此多妝引发能与家族II多肽交叉反应的抗体的能力。因此，本专利技术提供包含与SEQ ID N0:57有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽，其中一个或多个以下残基被另一氨基酸取代或删除F14 ；T16 ；Q18 ；Q20 ；D21 ；S22 ；E23 ；H24 ；S25 ；G26 ；K27 ；K31 ；Q33 ；R35 ；I36 ；G37 ；I39 ；K48 ；E51 ；G52 ；R54 ；T56 ；A67 ；G68 ；K70 ；T72 ；A78 ；A79 ；N83 ；K85 ；D97 ；D102 ；P105 ；G107 ；R109 ；S114 ；S116 ；L118 ；N120 ；Q121 ；A122 ；K135 ；T147 ；V148 ；N149 ；G150 ；I151 ；R152 ;H153。优选以下残基中至少一个倍被取代F14；T16 ；Q18 ；K31 ；Q33 ；R35 ；I36 ；G37 ；I39 ；T56 ；K70 ；T72 ；A78 ；A79 ；K85 ；D97 ；D102 ；S114 ；S116 ；L118 ;K135。参考文献 13 未选择这些残基中的任一个进行取代。优选进行取代或删除的氨基酸是F14；T16 ；Q1 8 ；Q20 ；D21 ；S22 ；E23 ；H24 ；S25 ；G26 ；K27 ；K31 ；Q33 ；R35 ；I36 ；G37 ；K48 ；E51 ；G52 ；R54 ；T72 ；A79 ；K85 ；P105 ；G107 ；R109 ；L118 ；N120 ；Q121 ；A122 ；T147 ；V148 ；N149 ；G150 ；I151 ；R152 ;H153。优选取代这些残基，而优选删除E51。优选用家族II或III的NMB1870中相应氨基酸来取代所述残基。因此，优选的取代是F14L ；T16I ；Q18K ；Q20N ；D21N ；S22P ；E23D ；H24K ；S25I ；S25T ；G26D ；K27S ；K31Q ；Q33S ；R35L ；I36V ；G37S ；I39L ；K48Q ；G52D ；R54K ；T56E ；A67P ；G68N ；K70R ；T72H ；A78T ；A79K ；N83H ；N83Y；K85R ；D97E ；D102E ；P105A ；G107E ；R109S ；S114L ；S116D ；L118R ；N120G ；Q121S ；A122E ；K135R ；T147I ；V148G ；N149E ；G150K ；I151V ；R152H ;H153E。该清单中只有残基25和83具有一个以上的优选取代残基，因为所有其它残基在家族I、II和III的两个家族中具有相同的氨基酸。所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 57有至少70%相同性，例如彡75%、彡80%、彡85%、彡90%、彡95%、彡96%、彡97%、彡98%、彡99%或更高。该序列可以是更大序列的一部分。给予宿主动物后，该多肽能诱导杀细菌的抗-脑膜炎球菌抗体，在优选的实施方式中，该多肽能诱导抵御三个NMB1870家族I-III中各家族菌株的杀细菌抗体。下文给出了杀细菌应答的其它信息。一种优选的氨基酸序列是SEQ ID N0:58，与SEQ ID NO:57相比，其以下残基被取代F14 ；T16 ；Q18 ；Q20 ；D21 ；S22 ；E23 ；H24 ；S25 ；G26 ；K27 ；K31 ；Q33 ；R35 ；I36 ；G37 ；K48 ；G52 ；R54 ；T72 ；A79 ；N83 ；K85 ；P105 ；G107 ；R109 ；L118 ；N120 ；Q121 ；A122 ；T147 ；V148 ；N149 ；G150 ；I151 ；R152 ;H153。残基 E51 被删除。另一取代的序列是SEQ ID N0:59o另一取代的序列是SEQ ID N0:60。用于取代的表面环已鉴定的SEQ ID NO: I表面环为⑴氨基酸164-168 ；⑵氨基酸179-182 ； (3)氨基酸 188-196 ； (4)氨基酸 203-208 ； (5)氨基酸 216-224 ； (6)氨基酸 233-237 ； (7)氨基酸 247-251 ;和(8)氨基酸 262-263。MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽，所述多肽含有的氨基酸序列与SEQ？ID？NO:57有至少70%相同，其中一个或多个以下残基被另一氨基酸取代或删除：F14；T16；Q18；Q20；D21；S22；E23；H24；S25；G26；K27；K31；Q33；R35；I36；G37；I39；K48；E51；G52；R54；T56；A67；G68；K70；T72；A78；A79；N83；K85；D97；D102；P105；G107；Rl09；S114；S116；L118；N120；Q121；A122；K135；T147；V148；N149；G150；I151；R152；Hl53。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：V·马西格纳尼，M·斯卡塞利，R·拉普奥里，M·皮扎，M·朱利亚尼，
申请(专利权)人：诺华疫苗和诊断有限公司，
类型：发明
国别省市：