本发明专利技术解决的课题是：创造出比现有的修饰型蛋白A配体具有更好的抗体酸解离特性的新型修饰蛋白A配体，而且创造出具有高的耐碱性的新型修饰蛋白A配体。本发明专利技术提供对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其具有源自蛋白A的E、D、A、B和C结构域中的任意结构域的氨基酸序列中的1个以上的Gly被Ala以外的氨基酸取代而得到的氨基酸序列，并且，与具有将所述Gly取代为Ala而得到的氨基酸序列的蛋白质相比，其对免疫球蛋白的Fab区域的亲和性低。而且，本发明专利技术提供对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其与对应的结构域相比，在碱性条件下的化学稳定性提高。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及与抗体特异性结合的蛋白质，和以该蛋白质作为免疫球蛋白结合性亲和配体的亲和分离基质，和使用该基质分离纯化或吸附去除抗体的方法。
技术介绍
抗体具有与被称为抗原的物质特异性结合的功能，以及与其他的生物体分子或细胞协同，将具有抗原的因子无毒化、去除的功能。所谓抗体的名称，是重视此类与抗原结合的功能的名字，作为物质则可称为“免疫球蛋白”。近年来，伴随着基因工程学、蛋白质工程学和细胞工程学的发展，利用具有抗体功能的医药制品——被称为抗体药物——的开发日渐盛行。与传统药物相比，由于抗体药物针对目标分子特异性的作用，因此预期使得副作用减轻，且获得更高的治疗效果，实际上有助于改善各种病况。一方面，由于抗体药物是向生物体大量施用的，相比与其他的重组蛋白质医药制品的情况下，可认为其纯度对质量产生极大的影响。因此，为了生产高纯度的抗体，利用特异性结合抗体的分子作为配体的吸附材料，一般使用亲和层析等手段。抗体医药制品的开发，基本上是单克隆IgG抗体，利用重组培养细胞技术等进行大量生产，利用对IgG抗体具有亲和性的蛋白质进行纯化。作为对IgG抗体具有亲和性的免疫球蛋白结合性蛋白质，蛋白A是已经公知的。蛋白A是由革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)产生的一种细胞壁蛋白质，由信号序列S、5个免疫球蛋白结合性结构域(E结构域、D结构域、A结构域、B结构域、C结构域)以及作为细胞壁结合结构域的XM区域组成(非专利文献1)。在抗体医药制品生产工艺的初期纯化工艺(捕获工艺) 中，蛋白A作为配体固定在水不溶性载体上的亲和层析柱(下文中为蛋白A柱)是通常使用的(非专利文献1、非专利文献2、非专利文献3)。为了改善蛋白A柱的功能，正进行各种技术的开发。配体方面的技术开发也不断进步。最开始利用天然类型的蛋白A作为配体，随之加入了蛋白质工程上的修饰而重组的蛋白A作为配体改善柱的功能的技术变得日渐多见。代表性的重组蛋白A可以列举去除了没有免疫球蛋白结合活性的XM区域的重组蛋白A(rProteinA S印harose (商标)，GE HealthCare日本株式会社生产)。以去除了 XM 区域的重组蛋白A作为配体的柱子，具有比传统产品降低的非特异性吸附的优点，目前在产业上也广泛应用。此外，有专利技术利用向蛋白A中突变导入1个Cys的重组蛋白A(专利文献1)，以及突变导入了多个Lys的重组蛋白A(专利文献2)作为配体。导入这类突变所获得的蛋白A 在固定化于水不溶性载体方面表现出效果，具有抗体对柱的结合容量和减少固定化配体的泄露的优点。作为加入了修饰的重组蛋白A，将向B结构域中导入了突变的修饰结构域(称为Z结构域)利用于配体的技术是广泛已知的(专利文献3、非专利文献1、非专利文献4)。相对于B结构域，Z结构域是导入了这样的突变的修饰结构域，其中四位Gly被Ala取代。需要说明的是，在Z结构域中同时导入用Val取代B结构域1位的Ala的突变，这是为了基因工程上以简化制备连接多个结构域的编码基因为目的的突变，对结构域的功能不产生影响 (例如，在专利文献4中，有使用突变体的实施例，其中Z结构域1位的Val被Ala取代)。已知Z结构域比B结构域的耐碱性更高，具有通过碱洗涤可反复使用的优点。以 Z结构域为基础，通过将Asn取代为其他的氨基酸，专利技术出赋予了更加耐碱性的配体(专利文献5、专利文献6)，并还开始了产业应用。Z结构域的另一个特征可例举为，与免疫球蛋白的Fab区域的结合力变弱(非专利文献5)。由于该特征，在将结合了的抗体用酸解离的工艺中，具有易于解离抗体的优点(非专利文献1、专利文献7)。除源自B结构域的Z结构域之外，作为高耐碱性的修饰蛋白A配体，也在不断进行以蛋白A的C结构域为基础的研究(专利文献4)。这类配体以发挥野生型C结构域本来具有的高耐碱性为特征，作为替代Z结构域的新的基础结构域而受到瞩目。然而，我们根据关于C结构域的验证结果，明确了在用酸解离与C结构域结合了的抗体的工艺中，存在抗体难以解离的缺点。在非专利文献2或专利文献4中，C结构域表现出与免疫球蛋白的Fab区域强的结合力，推测该特征可能是难以用酸解离抗体的原因。为了改善这一缺点，使用导入了以Ala取代四位的Gly的突变的C结构域，检验抗体的酸解离特性，虽然观察到了相比野生型C结构域的改善，但仍然是不充分的。根据蛋白质水平上的分子间相互作用解析的结果可知，就导入了用Ala取代四位的Gly的突变的C结构域而言，与免疫球蛋白的Fab区域的结合力降低不充分是其的原因。如上所述，对于蛋白A的免疫球蛋白结合性结构域(E、D、A、B和C结构域)而言， 导入用Ala取代四位的Gly的突变的有效性是已经公知的。实际上，自从1987年该“G29A” 突变公开以来，即使在涉及之后开发的修饰蛋白A的现有技术中，也导入了该“G29A”的突变(专利文献2、专利文献4、专利文献6)。但是，在蛋白A的免疫球蛋白结合性结构域的四位上已知的突变，仅仅是将四位的Gly取代为Ala的“G29A”，尚无对该位置导入Ala以外的氨基酸残基的突变的教导。Q9A 是基于考虑到应该使得立体结构上变化最小，仅次于Gly的侧链小的Ala最适合而导入的突变，迄今为止，尚未考虑过用具有更大侧链的氨基酸进行取代(非专利文献4)。因此，立体结构上的变化变大，可能会破坏原来的功能(与免疫球蛋白的结合能力等)，将四位的 Gly取代为比Ala侧链更大的氨基酸的突变，是否能表现出比Ala取代的突变更优秀的效果是不清楚的。尽管在1987年就公开了将四位的Gly取代为Ala的突变(非专利文献4)， 迄今为止也没有导入用Ala以外的氨基酸取代的突变。现有技术文献专利文献专利文献1 美国专利第6399750号公报专利文献2 特开2007-252368号公报专利文献3 美国专利第5143844号公报专利文献4 特开2006-304633号公报专利文献5 欧洲专利第1123389号公报专利文献6 国际公开第W003/080655号公报专利文献7 美国公开第2006/0194950号公报非专利文献非专利文献1 =Hober S.等著，J. Chromatogr :B，2007 年，848 卷。40-47 页非专利文献2 =Low D.等著，J Chromatogr :B，2007 年，848 卷，48-63 页非专利文献3 =Roque A. C. A.等著，J. Chromatogr. A，2007 年，1160 卷，44-55 页非专利文献4 :Nilsson B.等著，Protein Engineering，1987 年，1 卷，107-113 页5 Jansson B. ^FEMS Immunology and Medical Microbiology, 1998 年，20 卷，69-78 页专利技术_既述专利技术解决的技术问题本专利技术要解决的课题是开发这样的的修饰技术，所述技术创造出具有比现有的修饰型蛋白A配体更好的抗体酸解离特性的新型修饰蛋白A配体。此外，还以创造出具有高的耐碱性的新型修饰蛋白A配体作为课题。为了解决课题的手段本专利技术人为了解决上述课题，分子设计了多个重组的蛋白A变体，利用蛋白质工程的手段和基因工程的手本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其具有源自序列号１～５中记载的蛋白Ａ的Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ和Ｃ结构域中的任意结构域的氨基酸序列中的１个以上的Ｇｌｙ被Ａｌａ以外的氨基酸取代而得到的氨基酸序列，并且，与具有将所述Ｇｌｙ取代为Ａｌａ而得到的氨基酸序列的蛋白质相比，其对免疫球蛋白的Ｆａｂ区域的亲和性低。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：吉田慎一，村田大，高野昌行，赤木隼也，井口惠太，中野喜之，
申请(专利权)人：株式会社钟化，
类型：发明
国别省市：JP
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