重组人寡腺苷酸合成酶-1的制备方法技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及重组人寡腺苷酸合成酶-1（OAS1）的制备方法，依次包括步骤：1）化学合成OAS1蛋白基因表达序列；2）构建表达OAS1蛋白的重组工程菌；3）发酵培养产生包涵体形式表达的OAS1；4）获得包涵体并对其依次用含从低到高浓度的1-8mol/L的尿素的溶液进行洗涤，含每种浓度的尿素的溶液洗涤1次，共洗涤2-4次后用含6-8mol/L盐酸胍与同下步阳离子交换层析相同缓冲溶液体系的溶液进行变性处理；5）变性液上阳离子交换层析柱进行纯化处理，洗脱后得到纯度在95%以上的OAS1变性蛋白。采用该方法可在不添加有利于纯化的标签的情况下通过一步纯化原核表达系统表达的OAS1蛋白，使其纯度达到95%以上，更好的符合免疫与筛选抗体的需要。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般的涉及重组人寡腺苷酸合成酶的制备方法，特别的涉及。
技术介绍
慢性病毒性肝炎(HBV)是全球性的重大疾病，每年有50-120万人死于该病及由其引起的肝硬化和肝癌等。作为一线药物，虽然干扰素α (interferon α，IFNa)在HBV的治疗中具有抗病毒及免疫调节的双重作用，但临床上只有25% -50%的HBV患者使用IFNa 治疗有效。因此如何在早期通过IFNa作用原理预测IFNa治疗HBV的疗效，从而确定 IFNa适宜治疗HBV患者的对象，正确指导临床用药就显得十分关键。2，，-5，寡腺苷酸合成酶 0，，5，-Oligoadenylate synthetase，OAS)，简称寡腺苷酸合成酶(OAS)，是Kerr等在IFN α处理过的细胞提取液中发现的酶。经研究发现OAS的激活或生成是IFNa在治疗HBV的过程中发生药理作用的重要信号通路，因此其高低水平可用于判断IFNα是否适宜于特定HBV患者的治疗。IFNa 处理人细胞，主要诱导产生 OASl 0O/46kDa)、0AS2 (69/7IkDa)和 0AS3 (IOOkDa)三种类型OAS蛋白。在0AS1、0AS2、0AS3基因的5，区域，包含一个干扰素激活反应元件(ISRE)。OASl有两种亚型，分子量分别为40和46kDa，均具有相同的N端346个氨基酸，称为一个OAS单位。40kDa 0AS1C末端包含18个氨基酸，而46kDa蛋白则有M个氨基酸的延伸。0AS2有分子量分别为69和71kDa的两种亚型，它们N端有683个氨基酸的同源序列，包含两个OAS单位，与OASl的346个氨基酸OAS单位相比，分别有41 %和53 %的同源性，分别还有4和44个不同氨基酸序列延伸。干扰素剂量依赖性诱导，至少可能产生4. 5、 3. 9,3. 3,2. 8kb四种mRNA转录形式。其中3. 3kb mRNA编码7IkDa 0AS2，其他三种具有不同的3，末端，但同样编码69kDa0AS2。与OASl和0AS2不同的是，0AS3由7kb大小的mRNA编码，只有一种亚型，包含三个OAS单位，与OAS 1相比，有42 %，47 %和60 %的同源性。OAS基因家族簇生于人12号染色体上的一段1301Λ的区域内，它们具有相同的转录方向，按照5’-0ASl-0AS3-0AS2-3’的顺序排布。同时，在人12号染色体上还存在一段编码P59大小，与OASl序列具有同源性的蛋白，该蛋白与OASl和0AS2均可以和抗0AS3多克隆抗体发生交叉抗原抗体结合反应。但是该蛋白没有催化活性，称为OAS类似蛋白(OASL)。虽然，IFN α可诱导产生各种类型的OAS蛋白，但是，在不同的细胞中，可能存在不同的细胞因子调节各种类型及其亚型的表达，所以各类型及其亚型存在表达差异。但是总体来说，OASl在三种类型的OAS中在人体内表达量是最高的，分布也是最广的。在IFNCI和细胞膜上的受体作用下，细胞合成大量无活性的0AS，当有双链RNA或者具有微二级结构的单链RNA存在时，OAS被激活而具有催化活性，它以ATP为底物，催化合成2’ -5’寡腺苷酸(2-5A)，2-5A特异性结合并激活核酸内切酶(RNAse L)降解病毒的 mRNA及细胞的RNA，从而发挥抗病毒的作用。临床研究表明通过在用药前后检测OAS活性在一定程度上可以预测患者使用IFN治疗的疗效，从而指导临床合理用药。目前OAS的活性检测多采用放射免疫的方法，但该方法存在繁琐、费时、花费高的缺点，因此在临床推广应用上有一定的困难。而采用ELISA的方法，则可克服这些缺点，从而可通过检测患者体内OAS含量水平而推算体内OAS活性，从而为IFNa的临床用药提供切实的依据。ELISA检测中抗体的制备十分关键，而抗体的优劣很大程度上取决于所用抗原 OAS蛋白。目前关于OAS抗原的制备方法，一类是使用真核表达系统，虽然可不带标签表达OAS蛋白，但表达量较低，且纯化方法繁琐，花费高，费时长且所得OAS蛋白纯度不高 ’另一类是使用原核表达系统，一般表达带标签的OAS蛋白，虽然通过一步或少数几步纯化就可得到纯度较高的OAS蛋白，但是标签的存在会对纯化得到的OAS的免疫原性产生影响， 且会影响抗体的筛选。例如2008年12月第12卷第12期的《中国实验诊断学》杂志上在 1491-1493页发表的文章“2’ -5’寡腺苷酸合成酶的表达及其单克隆抗体的制备与应用”就公开了带His Tag标签的OAS蛋白的纯化方法。中国专利申请200780035985. X公开了一种利用原核包涵体表达系统表达OAS蛋白及其突变体并对表达的OAS蛋白及其突变体进行纯化的方法，虽然可以不使用标签表达纯化OAS蛋白，但是由于变复性过程对OASl蛋白的纯度提高有限，因此在之后的层析纯化中至少需要两步层析，例如先用肝素柱层析，再用Wienyl FF HP层析。这样表达纯化的结果是步骤依然复杂，整个过程收率低。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种OASl的制备方法，以在不添加有利于纯化的标签的情况下通过一步纯化原核表达系统表达的OASl蛋白，使其纯度达到95%以上，更好的符合免疫与筛选抗体的需要。为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是1)化学合成OASl蛋白基因表达序列；2)用适宜的表达载体和上述OASl蛋白表达基因序列构建重组表达载体，并通过适宜的手段转入基因工程工程菌构建表达OASl蛋白的重组工程菌；3)发酵培养上述重组工程菌，通过适宜的方式产生包涵体形式表达的OASl ；4)对发酵培养收获的工程菌进行破碎处理后获得包涵体，对包涵体依次用含从低到高浓度的l-8mol/L的尿素的溶液进行洗涤，含每种浓度的尿素的溶液洗涤1次，共洗涤 2-4次后用含6-8mol/L盐酸胍与同下步阳离子交换层析相同缓冲溶液体系的溶液进行变性处理；5)变性液上阳离子交换层析柱进行纯化处理，洗脱后得到纯度在95%以上的 OASl变性蛋白。在重组工程菌的构建过程中所述的表达载体优选pET表达质粒，并更优选 pET23b(+)表达质粒，所述的基因工程工程菌优选大肠杆菌工程菌，并更优选大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS0在发酵培养过程中培养基优选LB培养基，或在LB培养基的基础上进一步添加或优化成分组成的培养基，如F. William Studier在Protein expression and purification 2005 年第 41 卷第 27-34 页发表的文献 Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures 中 艮道的自动诱导培养基(Auto-induction medium)包涵体的破碎处理可以选择超声波破碎法、高压勻浆法、球磨法等，优选超声破碎法以减少细菌染色体内物质在破碎过程中的释放。在包涵体洗涤过程中，洗涤用的溶液中除含有l-8mol/L的尿素外，还优选含有去垢剂、螯合剂和/或还原剂等成分来增强洗涤效果。所述的去垢剂例如可选SDS、Triton X-100、吐温20、吐温80、NP-40等中的一种或几种的组合，优选Triton X-100 ；所述的螯合剂例如可选EDTA、本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种ＯＡＳ１蛋白的制备方法，其特征是依次包括如下步骤：１）化学合成ＯＡＳ１蛋白基因表达序列；２）用适宜的表达载体和上述ＯＡＳ１蛋白表达基因序列构建重组表达载体，并将重组表达载体通过适宜的手段转入基因工程工程菌构建表达ＯＡＳ１蛋白的重组工程菌；３）发酵培养上述重组工程菌，通过适宜的方式产生包涵体形式表达的ＯＡＳ１；４）对发酵培养收获的工程菌进行破碎处理后获得包涵体，对包涵体依次用含从低到高浓度的１－８ｍｏｌ／Ｌ的尿素的溶液进行洗涤，含每种浓度的尿素的溶液洗涤１次，共洗涤２－４次后用含６－８ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍与同下步阳离子交换层析相同缓冲溶液体系的溶液进行变性处理；５）变性液上阳离子交换层析柱进行纯化处理，洗脱后得到纯度在９５％以上的ＯＡＳ１变性蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周敏毅，李孜，徐晨，刘金毅，程永庆，
申请(专利权)人：北京三元基因工程有限公司，北京毕艾欧科技发展有限责任公司，
类型：发明
国别省市：11