本发明专利技术涉及一种与抗癌基因编码产物ｐＲＢ相作用的人体蛋白质编码基因ｐＲｂ－ＢＰ７６，它由ｃＤＮＡ由１４０３个核苷酸组成，编码序列编码２４７个氨基酸组成的蛋白质，通过同源性比较确认其为人类Ｖ型ＡＴＰａｓｅＤ亚基的编码基因。它在人体的正常组织中广泛表达。ｐＲｂ－ＢＰ７６基因定位在第１４号染色体ｑ２３．１－２４．１区段。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及与抗癌基因编码产物pRB相作用的人体蛋白质编码基因pRb-BP76及它在人体各组织中的表达和在染色体上的定位，以探索肿瘤诊断和治疗的新途径。Rb基因是人类报道最早的肿瘤抑制基因，其正常的编码蛋白不仅是一种重要的细胞增殖抑制因子，还广泛参与了细胞分化、细胞凋亡、抑制肿瘤形成等多种复杂的生理过程(Mulligan，G.，TIG，1998，14223-229；Knudsen，E.S.et al.，Genes & Dev.，1998，122278-2292；Luo，R.X.，etal.，Cell，1998，92463-473；Macleod，K.，Curr.Opin.Genet.Dev.，1999，9(1)31-39)其核心环节就是DNA与蛋白质，蛋白质与蛋白质相互作用，Rb发生作用主要是通过影响转录来实现的，它通过与多种转录因子的相互作用对转录发生正调控或负调控。正常的Rb具有抑癌功能，但Rb基因的一些缺失或突变所造成的突变体由于丧失了对细胞增殖、分化等的正常控制而导致细胞癌变。常见的由于Rb突变所导致的肿瘤有视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、小细胞肺癌、前列腺癌和膀胱癌(Paggi，M.G.，et al.，J.Cell Biochem.，1996，62418-430)。此外，Rb还是一些小的DNA肿瘤病毒的病毒抗原(如腺病毒的E1A蛋白、SV40的大T抗原)的早期作用因子。因此，Rb与各蛋白质因子之间的相互作用显得尤为重要，已成为人们注意的焦点。过去几年来，人们已经克隆了许多编码产物能够与pRB相作用的基因(Weinberg，R.A.，Science，1991，2541138-1146；Cavanaugh，A.H.，et al.，Nature，1995，374177-180；Wang，C.Y.，et al.，Science，1993，2601330-1335；Dunaief，J.L.，et al.，Cell，1994，79119-130；Woitach，J.T.，et al.，Nat.Genet.，1998，19(4)371-374；Simons，A.，et al.，Oncogene，1997，14(2)145-155)，一方面研究这些因子的结构特征，寻找它们与pRB的作用规律，另一方面致力于研究它们的功能。这两方面的研究为阐明pRB参与细胞各项生理过程的调控机制奠定了基础。同时研究Rb与其他蛋白质因子的相互作用，有助于探讨肿瘤的发病机制，为肿瘤的诊断和治疗提供新的设想和方案。酵母双杂交系统是近年来发展起来的一种在体内研究蛋白质之间相互作用的体系(Chien，C.T，et al.Proc.Acad.SCi.USA，1991，889578-9582)该系统的原理是基于酵母中的一种转录因子GAL4功能的重建。GAL4分子含有两个相对独立的功能域DNA结合区和转录激活区。把欲验证存在相互作用的两个蛋白质(X和Y)的基因分别与GAL4的DNA结合区和转录激活区融合，再将这两个融合表达载体转入特殊的酵母细胞中，此酵母菌的染色体上，已整合了可被GAL4的DNA结合区所识别并结合的位点及下游报告基因(HIS3或LacZ)，如果两个蛋白质之间发生相互作用，报告基因就能表达。蛋白质Y也可是一个基因文库，这样就可以从中筛选与蛋白质X相互作用的新蛋白质基因。为此，本专利技术的目的是提供一种能与抗癌基因编码产物pRB相作用的人体蛋白质编码基因pRb-BP76全长cDNA序列，并表明它在8种正常人组织中的表达水平及在染色体上的定位，在肿瘤的诊断和治疗上具有潜在的应用意义。本专利技术是一种与抗癌基因编码产物pRB相作用的人类新基因pRb-BP76，它是根据上述情况，利用pRB融合GAL4的DNA结合区，作为蛋白质X，以人胎脑cDNA文库融合GAL4的转录激活区为蛋白质Y，筛选到了一个人类新基因pRb-BP76。经PCR方法钓到了全长cDNA片段，测定了全序列，并进行了染色体定位和在8种正常人组织中的Northern杂交分析，为研究pRB的作用原理开辟了新的途径。本专利技术以pRB为靶分子，利用酵母双向杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选到多个阳性克隆，测定各阳性克隆的cDNA序列，得到一个长度为1052bp的cDNA序列(序列表SEQ ID NO1)，该cDNA序列编码一个182个氨基酸的肽段(序列表SEQ ID NO2)，包括一段3’非编码区，但5’编码区不全。Northern杂交的结果表明，该基因全长mRNA约为1.4kb。查询EST数据库进行拼接，在3’端又延伸了一段。在已经拿到的pRb-BP76序列的5’端反向设计一个引物作为3’引物，用人胎脑cDNA文库的载体臂上的一段序列作为5’引物(序列表SEQ ID NO5)进行PCR反应，得到一段约0.6kb的扩增片段，测定其核苷酸序列后，可与前面的片段共同拼接成pRb-BP76基因全长cDNA，长度为1403bp(序列表SEQ ID NO3)。其中5’非翻译区为85bp，编码区为744bp，编码247个氨基酸组成的蛋白质(序列表SEQ ID NO4)，3’非翻译区为674bp。(图1)经基因数据库检索发现，完整的pRb-BP76与牛的V型ATPase的D亚基编码基因有很高的同源性，其中核酸的同源性为87％，蛋白质水平的同源性为99％，确定pRb-BP76为人类的V型ATPase的D亚基编码基因。进行8种正常人组织mRNA的Northern杂交分析，结果表明该基因在各种组织中广泛表达(图2)，但在心脏、脑、肾脏和胰脏这样一些分泌活动较为旺盛的组织中表达量要更高一些。本专利技术还利用辐射杂交细胞系法(Radiation hybrid，简称RH)进行了pRb-BP76基因的染色体定位分析。在pRb-BP76基因3’非编码区合成一对引物(序列表SEQ ID NO6)，对RH Mapping Kit中的83个辐射杂交细胞株的模板进行PCR反应，实验结果在计算机中进行连锁和统计分析，将该基因定位于第14号染色体的q23.1-24.1区段。本专利技术的优点与功能1、提供一种全新的pRb-BP76基因的cDNA序列，它的编码产物能与抗癌基因的产物pRB相作用，在肿瘤的诊断和治疗上具有应用意义。2、pRb-BP76在8种正常人组织中广泛表达，显示该基因在细胞内具有重要功能作用，可作为诊断指标。3、本专利技术已将pRb-BP76基因定位在14号染色体的q23.4-24.1区段，宜进行染色体上基因的连锁分析，应用于疾病的诊断。4、因为V型ATPase的D亚基在ATP水解和质子泵的偶联中发挥作用，而迄今为止尚未有文献报道pRB参与此过程，因此确定pRb-BP76为人类V型ATPase的D亚基编码基因，这为进一步了解Rb更多的功能提供了线索。本专利技术通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本专利技术的范围。 附图说明图1.pRb-BP76cDNA片段的克隆图中280-1331位即SEQ ID NO1中的核苷酸序列图中1-630位为PCR延伸出的pRb-BP76的5’端图中1331bp后的序列为在EST库中拼接出的序列图2.以pRb-BP76为探针，人不同组织mRNA的Northern杂交图中 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种与抗癌基因编码产物ｐＲＢ相作用的人体蛋白质编码基因ｐＲｂ－ＢＰ７６，其特征在于它为人类Ｖ型ＡＴＰａｓｅ Ｄ亚基的编码基因，具有如序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所示的ｃＤＮＡ核苷酸序列和如序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：敖世洲，闻宏，李权，
申请(专利权)人：中国科学院上海生物化学研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。