与人Ha-ras基因片段互补的经修饰的反义核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及与人Ｈａ－ｒａｓ基因和ｍＲＮＡ片段互补的特异并修饰的寡核苷酸，及其特异调节、调整或抑制Ｈａ－ｒａｓ基因表达的用途，以及在Ｈａ－ｒａｓ基因异常表达所引起的疾病的治疗中充当药物的用途，尤其与化疗和放疗的联合使用。本发明专利技术经修饰的寡核苷酸含有５’－ＴｘＡｘＴｘＴｘＣｘＣｘＧｘＴｘＣｘＡｘＴ－３’－Ｏ－ＰＯ↓［２］－Ｏ－Ｒ序列，其中Ｘ是Ｏ或Ｓ，前提条件是Ｘ有４－９次为Ｓ，而Ｏ指磷酸二酯核苷间键，Ｓ指硫代磷酸酯核苷间键。Ｒ是Ｃ↓［８］－Ｃ↓［２１］烷基，－（ＣＨ↓［２］－ＣＨ↓［２］Ｏ）ｎ－（ＣＨ↓［２］）ｍ－ＣＨ↓［３］或－ＣＨ↓［２］－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ↓［２］Ｏ－（ＣＨ↓［２］）ｑ－ＣＨ↓［３］，其中ｎ是１－６的整数，ｍ是０－２０的整数，ｑ是７－２０的整数，Ａ是２’－脱氧腺苷，Ｇ是２’－脱氧鸟苷，Ｃ是２’－脱氧胞苷，Ｔ是胸苷。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及与人Ha-ras基因和mRNA片段互补的特异并修饰的寡核苷酸，及其特异性调节、调整或抑制Ha-ras基因表达的用途，以及在Ha-ras基因异常表达所引起的疾病的治疗中用作药物的用途。反义寡核苷酸(AO)已在大量的体内和体外系统中被证明是基因表达的特异性抑制剂(Uhlmann和Peyman，Chem.Rev.1990，90，543)。使用只含磷酸二酯核苷间键的未经修饰的寡核苷酸(PO-寡核苷酸)时遇到的一个主要问题是，此类寡核苷酸在细胞和生物流体(例如血液和脑脊液)中被一定范围内的核酸水解活性所迅速降解。为了提高它们的核酸水解稳定性，对寡核苷酸进行了广泛的化学修饰(Uhlmann和Peyman，Chem.Res.1990，90，543)。这些修饰包括对磷酸二酯核苷间键、糖基、核苷碱基或寡核苷酸的糖-磷酸主链进行修饰或取代。研究最充分的修饰类型是核苷间键的改变，包括硫代磷酸酯(PS)键、甲基磷酸酯(MeP)键和二硫代磷酸酯(Phosphorodithioate，PSS)键。应该强调的是寡核苷酸的修饰不仅改变了它的核酸酶稳定性，还改变了寡核苷酸的其它特性，例如它们的细胞摄取，RNaseH活性，和它们的目标核酸结合的强度和特异性，等等。应该了解的是，经修饰的寡核苷酸在血清中的稳定性，常用于测定寡核苷酸的核酸酶稳定性，这种稳定性并不是细胞内稳定性的唯一决定因素(P.D.Cook，《反义研究与应用》，Crooke和Lebleu(编)CRC Press，Boca Raton，1993，第9章，149页)。硫代磷酸酯(PS)修饰的寡核苷酸是经修饰的寡核苷酸中使用最广的类型。为了确定将PS连接置于反义寡核苷酸中的位置，建立了下述策略(1)用硫代磷酸酯键取代所有的磷酸二酯核苷间键。产生的全部硫代磷酸酯寡核苷酸对核酸酶比PO-寡核苷酸要稳定得多(Monia等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)1996，271，14533)。例如，全部PS寡核苷酸在内切核酸酶作用下的降解相对于PO寡核苷酸减慢了2-45倍(Stein等人，核酸研究(Nucleic AcidResearch)，1988，16，3209)。在爪蟾卵母细胞或胚胎中，微量注射的PO-寡核苷酸的降解以半衰期30分钟的速度进行，而全部PS-寡核苷酸在相同条件下半衰期超过3小时(Woolf等人，核酸研究，1990，18，1763)。全部PS-寡核苷酸保留了它们激活RNaseH的能力。全部PS-寡核苷酸的主要不利之处在于它们与目标核酸形成稳定杂合体的能力降低了，并且常常有非特异的“非反义”效应(Monia等人，生物化学杂志，1996，271，14533)。(2)同时含有硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷间键的寡核苷酸。为了克服在全部PS-寡核苷酸中观察到的非反义效应，合成了同时含有硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷间键的寡核苷酸，并检测了其稳定性和生物学活性。Ghosh等人(抗癌药物设计(Anticancer Drug Design)，1993，8，15)描述了含有不同百分比PS连接的PS-PO寡核苷酸。他们的构建沿循下例式样(PS-PO-PO-PO)n’(PO-PO-PS)n’(PS-PO)n’n’n。他们告知，为达到体外选择性翻译抑制作用，要求PS键含量至少50％，而当PS含量少于50％时，活性猛烈下跌。最近已证明，以(PS-PO)n式样排列而含50％PS键的寡核苷酸在一个检测系统中显示没有生物学活性，而此实验系统中相同序列的全部PS-寡核苷酸和“末端封盖”的PO-PS寡核苷酸(见下文)有很高活性(Monia等人，生物化学杂志，1996，271，14533)。(3)“末端封盖”的寡核苷酸，此寡核苷酸5’和/或3’末端的一个，两个或三个核苷间桥被硫代磷酸酯修饰。(也称为“缺口技术”)这种修饰类型主要是为了防止寡核苷酸在外切核酸酶作用下降解而设计的。特别是寡核苷酸3’-末端的修饰是想要的，因为这样可以保护寡核苷酸免受血液中最丰富的核酸酶-3’-外切核酸酶的作用(Uhlmann和Peyman，Chem.Rev.1990，90，543)。Hoke等人(核酸研究，1991，19，5743)对这些策略做了一个有趣的比较。作者比较了针对HSV-1的一些反义PS-寡核苷酸在细胞培养物中的活性。他们的发现证明，3’或3’+5’末端封盖的寡核苷酸(在每一例中前三个核苷间键被修饰了)，与全部PS-寡核苷酸相似，它们受到了充分保护，能够免受血清中核酸酶的降解。相反，内部修饰(三个PS桥)的寡核苷酸和只有5’-末端被封盖的寡核苷酸(也是前三个核苷间键被修饰了)被迅速降解。相反地，作者发现，不管是5’还是3’末端封盖或是两末端封盖对细胞内的活性都不够充分，他们得出结论，一致的修饰(全部PS)是获得对细胞内核酸酶充分稳定性所需要的。近来发现，嘧啶核苷是寡核苷酸内对核酸酶最敏感的位点(Peyman，A.和Uhlmann，E.，Hoppe-Seyler生物化学1996，377，67；EP0 653 439 A2)。已发现，末端封盖和寡核苷酸嘧啶位点PS保护的组合(所谓的“最小修饰”方法)足够使它们对核酸酶降解有高度耐受性。用这种PS式样修饰的寡核苷酸的生物学活性(针对单纯疱疹病毒)与全部PS-寡核苷酸相当。使用AO时不管它们是否对降解比较稳定，遇到的一个主要问题是它们的不良细胞摄取。已进行了许多探索，企图改善这个问题。这些探索的大多数围绕着将各种物质连接到寡核苷酸上进行。修饰包括将肽连接到寡核苷酸上(Lemaitre，M.等，美国科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)1987，84，648)和将亲脂性残基，如烷基链或胆甾醇，连接到寡核苷酸上(Saison-Behmoaras，T.等，EMBOJ.，1991，10，1111-1118；Will，D.W.和Brown，T.，四面体通讯(TetrahedronLett.)，1992，33，2729)。然而，已发现，在很多情况下亲脂性基团的引入会引起不依赖于寡核苷酸序列的生物学效应。已经有关于胆甾醇-寡核苷酸缀合物(Henderson，G.B.和Stein，C.A.核酸研究，1995，23，3726)和连接到烷基链上的寡核苷酸(Shen，R.G.等人，核酸研究，1990，18，3777)的非特异效应的报导。Saison-Behmoaras等人(EMBO J.1991，10，1111-1118；WO 96/34008)报导了用3’-十二烷醇部分和5’-吖啶交联剂衍生且反义于突变Ha-ras的9聚体全部PO-寡核苷酸抑制了T24人膀胱癌细胞的增殖。对这种寡核苷酸与无十二烷醇缀合的相应寡核苷酸的抗增殖活性未做比较。在T24细胞中，十二烷醇寡核苷酸的细胞摄取据报导是未经修饰的寡核苷酸的4倍。吖啶-十二烷醇修饰的寡核苷酸对携带未突变Ha-ras基因的人乳房细胞系的增殖没有影响。这种效应可能归因于反义寡核苷酸的序列特异性，或归因于细胞摄取不足。既然未测定到吖啶-十二烷醇寡核苷酸在人乳房细胞系中的摄取，则这种效应可能完全，或者至少部分是因为寡核苷酸没有被人乳房细胞系吸收，因而没有机会显示其对细胞增殖的非序列特异性效应。大约20％的人类本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有下述序列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的经修饰的寡脱氧核苷酸：５’－ＴｘＡｘＴｘＴｘＣｘＣｘＧｘＴｘＣｘＡｘＴ－３’－Ｏ－ＰＯ↓［２］－Ｏ－Ｒ其中ｘ 是ｏ或ｓ，前提是ｘ有４－９次为ｓ，且ｏ 指磷酸二酯核苷间键，ｓ 指硫代磷酸 酯核苷间键，Ｒ 指Ｃ↓［８］－Ｃ↓［２１］烷基，－（ＣＨ↓［２］－ＣＨ↓［２］Ｏ）ｎ－（ＣＨ↓［２］）ｍ－ＣＨ↓［３］或－ＣＨ↓［２］－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ↓［２］Ｏ－（ＣＨ↓［２］）ｑ－ＣＨ↓［３］，其中ｎ是１－６的整数，ｍ是０～２０的整 数，而ｑ是７～２０的整数，并且Ａ 指２’－脱氧腺苷，Ｇ 指２’－脱氧鸟苷，Ｃ 指２’－脱氧胞苷和Ｔ 指胸苷。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：E乌尔曼，A培曼，DW威尔，E常，K皮若洛，A莱特，
申请(专利权)人：萨诺费阿文蒂斯德国有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]