利用结合到聚合物载体上的酶催化大分子复杂反应的方法技术

本发明专利技术涉及利用结合到聚合物载体上的酶催化大分子复杂反应的方法，即涉及酶催化的反应，在该反应过程中通常发生所不需要的次级反应或副反应。按照本发明专利技术，通过选择无孔或几乎无孔的载体材料，在最大程度上避免了所不需要的次级反应或副反应。本发明专利技术尤其涉及利用结合到聚合物载体上的酶从生物学上无活性的前体酶催获得生物分子的方法，生物分子优选为肽、蛋白质、低聚糖或多糖，尤其是利用结合到聚合物载体上的酶从对应的前体获得胰岛素或其类似物的方法。选择无孔或几乎无孔的载体材料的结果是，该方法可选择性地生成生物分子，尤其是胰岛素或胰岛素类似物和能够分解成为胰岛素或其类似物的相应有用物质，并且在最大程度上避免了所不需要的次级反应或副反应。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，该复杂反应伴有所不需要的次级反应或副反应，特别是涉及利用结合到聚合物载体上的酶从生物学上无活性的前体、例如前胰岛素原酶催得到生物分子的方法，特别是生物活性肽、例如胰岛素或其类似物，以及蛋白质、低聚糖或多糖。利用不同方法制备人胰岛素及其衍生物在文献中有所描述。化学合成法由于目标分子的复杂性，是不经济的，除此以外，还有半合成法和遗传工程的方法。在半合成法中，胰蛋白酶催化猪胰岛素B链的C-端氨基酸的取代反应，导致人胰岛素的生成(H.-D.Jakubke等《应用化学》(Angew.Chem.)97(1985)79)。制备人胰岛素的遗传工程方法要经过前胰岛素原及其衍生物阶段，其在处理中同样是要进行胰蛋白酶裂解的(B.H.Frank等《肽合成、结构、功能》(1981)729-738；Jonasson等《欧洲生物化学杂志》236 2(1996)656-661；Kemmler等《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)246(1971)6786-6791)。为了在半合成法中有效利用酶，人们发展了一种允许使用固定化胰蛋白酶的方法(EP0294851)。至于从对应的、用遗传工程制备的前胰岛素原得到胰岛素或其类似物，已知还没有一种酶催方法中的胰蛋白酶是以固定化形式存在的，因此在已知方法中，一方面，对每批新的反应来说必须加入新的胰蛋白酶，另一方面，在产物纯化的过程中，耗费的酶的贫化是必要的。前胰岛素原(PPI)的胰蛋白酶裂解是一个复杂的、酶催化的反应，伴有大量的、所不需要的次级反应和副反应。如图1所示，由于存在大量反应性部位，在PPI的胰蛋白酶裂解中生成大量反应产物，其中化合物Arg(B31)、Arg(B32)-胰岛素(“二-Arg”(“di-Arg”))和Arg(B31)-胰岛素(“单-Arg”(“mono-Arg”))被认为是对进一步处理具有实际价值的物质。因此，除去前序列和“中间”C链(排列在胰岛素的A链序列与B链序列之间的前胰岛素原中的C链)都是必要的。如果裂解反应发生在PPI的其他部位，那么生成所不需要的副产物，例如脱(B30)-胰岛素(“脱-Thr”(“des-Thr”))。尽管天然胰蛋白酶的裂解主要生成两种有用物质，Arg(B31)、Arg(B32)-胰岛素(“二-Arg”)和Arg(B31)-胰岛素(“单-Arg”)，而使用基于常规载体的胰蛋白酶固定化物的反应模式是不令人满意的，常规载体例如有EupergitC250L、EupergitC、Deloxan。这里，两种有用物质二-和单-Arg只是少量生成，而主要生成所不需要的次级产物或副产物(大部分是脱-Thr)。本专利技术的目的是提供利用结合到聚合物载体上的酶催化大分子复杂反应、也就是酶催化的反应的方法，该反应通常发生所不需要的次级反应或副反应，该方法在最大程度上避免了所不需要的次级反应或副反应。本专利技术的目的尤其是提供利用结合到聚合物载体上的酶从生物学上无活性的前体得到生物分子的酶催方法，生物分子优选为肽、蛋白质、低聚糖或多糖，特别是利用结合到聚合物载体上的酶从对应的前体得到胰岛素或其类似物的方法，该方法在最大程度上避免了次级反应或副反应，选择性生成生物分子，特别是胰岛素或胰岛素类似物，以及有关的、能够裂解得到胰岛素或其类似物的有用物质。该目的是这样达到的，利用结合到聚合物载体上的酶催化大分子的复杂反应，该反应通常发生所不需要的次级反应或副反应，其中该聚合物载体材料没有或几乎没有使酶能够在孔内结合到载体上的足够大的孔。该目的进一步是这样达到的，利用一种或多种结合到聚合物载体上的酶用酶催方法从生物分子前体得到生物分子，生物分子选自由肽、蛋白质、低聚糖或多糖组成的组，其中该聚合物载体材料没有或几乎没有使酶能够在孔内结合到载体上的足够大的孔。根据本专利技术的方法优选适合于利用一种或多种结合到聚合物载体上的酶从对应的前体、特别是前胰岛素原得到胰岛素或其类似物。胰岛素类似物得自天然来源的胰岛素，也就是人胰岛素或动物胰岛素，例如猪胰岛素或牛胰岛素，方法是取代或去掉至少一个天然来源的氨基酸残基，和/或向天然来源的胰岛素的A和/或B链加入至少一个氨基酸残基。优选地，聚合物载体材料是单体甲基丙烯酰胺和N,N’-双(甲基丙烯酰胺)的共聚物，聚合物载体材料特别优选地具有含环氧乙烷基的单体。在根据本专利技术的方法中，酶优选地借助于环氧乙烷基以共价方式结合到载体材料上。在从对应的前体、特别是前胰岛素原得到胰岛素或其类似物的优选方法中，所用的酶优选为胰蛋白酶。在这种情况下，固定在载体上的酶优选地具有0.05至0.5U/ml的活性，反应溶液的pH值优选为6至10，特别优选为7至9。下列特别要依靠实施例更加详细地阐述本专利技术。在大量固定化作用中，使胰蛋白酶以共价方式结合到不同的载体材料(EupergitC、Eupergit250L、Deloxan)上。不过，在前胰岛素原(PPI)的裂解中使用这些固定化物仅少量产生所需的有用物质二-或单-Arg，即使改变各种反应参数也是如此，例如改变pH值、温度或酶的浓度。相反，主要生成所不需要的副产物，例如脱-Thr。当使用固定在无孔载体EupergitC1Z上的胰蛋白酶时，惊人地按照天然使用所需的模式发生PPI裂解。于是在胰蛋白酶的固定化作用中选择无孔载体、例如EupergitC1Z第一次在PPI裂解中允许酶的反复使用，同时具有良好的、有利于两种有用物质二-和单-Arg的选择性。类似于半合成法使用固定化胰蛋白酶的重要性在于易于从反应溶液中分离催化剂，并且可以反复使用，因此可能用于制备人胰岛素的遗传工程方法。实施例实施例1蛋白质在聚合物载体上的固定化作用实施例1.1 Deloxan蛋白质在Deloxan上的固定化作用要求预先用戊二醛活化载体。在酶的实际固定过程中，给定胰蛋白酶的天然活性在一系列测量中是变化的。活化pH值=9 T =25℃t =1hDeloxan =10gGD =0.2g/g TM固定条件pH值=9T =25℃t =3h实施例1.2 EupergitC250L和EupergitC在胰蛋白酶在Eupergit载体上的固定化作用中，将载体悬浮液与酶溶液在单一阶段反应中混合。对EupergitC250L的固定条件pH值=8 T =25℃t =3d对EupergitC的固定条件pH值=8.5 T =25℃t =3d苄脒=24mM实施例1.3 EupergitC1ZEupergitC1Z载体区别于其他载体的特征是不含孔。固定条件pH值 =8 T=25℃t=3d天然胰蛋白酶=7400U/gTM在给定条件下，特异性活性达到405U/g TM。在固定率相当于其他两种Eupergit载体的结果的情况下，46％的回收率显然是较高的。实施例2向玻璃烧杯中加入浓度为0.83mg/ml的1 l前胰岛素原溶液。pH值设定在8.3后，加入固定在Deloxan上的胰蛋白酶，浓度为0.81U/ml，裂解反应开始。在整个反应期间，溶液的温度是6℃。加入1M NaOH溶液以保持pH值在反应过程中恒定。每隔一定的时间对反应溶液取样，历经23小时，利用HPLC测定各反应组分的本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用结合到聚合物载体上的酶催化大分子复杂反应的方法，其中该聚合物载体材料没有或几乎没有孔。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：J邦斯，J梅维斯，
申请(专利权)人：萨诺费阿文蒂斯德国有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]