本发明专利技术属于植物基因工程领域，公开了一种大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶及其编码基因与应用。该大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶，具有SEQ?ID?NO.2所述氨基酸序列，其编码基因GmGMP1具有SEQ?ID?NO.1所示的DNA序列。转GmGMP1基因拟南芥和野生型拟南芥相比，转基因植株叶片中总维生素C含量明显高于野生型拟南芥。可见本发明专利技术大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶及其编码基因可用于培育高维生素C含量的植物品种特别是大豆品种。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程领域，涉及一种大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶及其编码基因与应用。
技术介绍
维生素C又叫抗坏血酸(L-ascorbic acid, AsA)，是植物和大多数动物体内合成的一类己糖内酯化合物。维生素C在生物体中不仅具有抗氧化作用而且具有重要的代谢功能。研究发现，植物中，维生素C与植物的抗逆性表现为正相关性，提高植物细胞内的维生素C的含量，能使植物耐炎热、寒冷和盐碱等逆境的能力得到增强。维生素C是人类和动物维持生长、繁殖和保证健康所必需的营养物质。植物、微生物和大多数动物体内可自行合成维生素C，但是人类、猿猴、天竺鼠等自身已经丧失了合成能力，必须从食物中摄取，而新鲜蔬菜和水果是维生素C最好的来源。因此维生素C含量已成为衡量农产品品质的重要指标。⑶P-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMPase)是植物中维生素C合成途径L-半乳糖途径中第一步反应所需要的酶，催化D-甘露糖-I-P生成⑶P-D-甘露糖。目前已经从烟草 (AB066279)、土豆(AF022716)、拟南芥(AF076484)、金虎尾(DQ2^168)、番茄(AY605668)等多个物种中获得了编码GMPase的基因。大豆中GMPase基因的序列还未见报道。提高菜用大豆维生素C含量，提高菜用大豆的营养品质，对提高农业经济效益和改善人类生活质量具有积极而深远的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶。本专利技术的另一目的是提供该大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶的编码基因。本专利技术的又一目的是提供该基因的应用。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现本专利技术所提供的大豆⑶P-D-甘露糖焦磷酸化酶，名称为GmGMPl，来源于大豆属大豆，具有SEQ ID NO. 2所述的氨基酸序列。上述大豆⑶P-D-甘露糖焦磷酸化酶的编码基因GmGMPl，其CDNA基因具有SEQ ID NO. 1所示的DNA序列，该序列为GmGMPl基因的读码框，编码具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶。含有编码大豆⑶P-D-甘露糖焦磷酸化酶的基因的表达载体。所述的表达载体优选以pBI121为出发载体，将编码所述的大豆⑶P-D-甘露糖焦磷酸化酶的基因GmGMPl插入到pBI121质粒的)(ba I和BamH I酶切位点间得到的植物过量表达载体pBI-GmGMP 1。含有所述的编码大豆⑶P-D-甘露糖焦磷酸化酶的基因的工程菌。该工程菌优选利用基因工程手段将GmGMPl基因转入的根癌农杆菌菌株EHA105所得。本专利技术所述的大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶在培育高维生素C含量的植物中的应用。本专利技术所述的大豆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶编码基因在培育高维生素C含量的植物中的应用。有益效果本专利技术首次从大豆中克隆出了 GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因，通过构建植物过量表达载体pBI-GmGMPl，对该基因进行过量表达，发现过量表达GmGMPl的拟南芥与野生型拟南芥相比，其维生素C (抗坏血酸)含量显著提高，说明GmGMPl基因在提高植物维生素 C (抗坏血酸)含量方面起着重要作用。本专利技术大豆⑶P-D-甘露糖焦磷酸化酶(GmGMPl)及其编码基因GmGMPl对培育高维生素C (抗坏血酸)农作物，提高农作物营养品质的影响特别是对菜用大豆营养品质的影响具有重要意义。附图说明图1为大豆GMPl与其他物种的GMPase的氨基酸序列多重比较。图2为含有GmGMPl的植物表达载体的结构示意图。图3ASA标准曲线，其中纵坐标为OD对照-OD反应后，横坐标为ASA含量，单位为 0. 01mg/ml。图4DHA标准曲线，其中纵坐标为OD5^-ODfiisjs,横坐标为DHA含量，单位为 0. Olmg/ml。图5为转GmGMPl拟南芥株系与野生型拟南芥的叶片中总维生素C含量示意图，其中纵坐标单位为mg/100g。具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明，均为本领域的常规方法。实施例IGmGMPl基因的分离与克隆用已发表的拟南芥⑶P-甘露糖焦磷酸化酶序列(AtGMP，AF076484)为探针，搜索 GenBank (http//www. ncbi.nlm. nih. gov. blast)禾口 Gene Index(http://compbio. dfci. harvard, edu/tgi/)数据库，得到了匹配的大豆EST序列，进行EST片段拼接，得到了一个GMPase基因片段，该GMPase基因片段的⑶S序列在大豆基因组上的位置为 Glymal4g07150,设计 PCR 扩增引物，正向引物 F :5 ‘-ATGAAGGCATTGATTCTGG-3，(SEQ IDN0. 3)；反向引物 R 5 ‘-CATGACAATCTCCGGCTTC-3，(SEQ ID N0. 4)。以大豆品种波高(来自国家大豆改良中心种子库)的总cDNA为模板，进行PCR获得GmGMPl读码框序列，PCR 扩增反应体系为1μ 1大豆cDNA(0. 05yg)、ly 1引物对(10μΜ)、2. 5μ 1 10XPCR缓冲液、2. 5 μ 1 Mg2\4y 1 dNTP (IOmM)和 1. 25U LA Taq DNA 聚合酶，用超纯水补足 25 μ 1。反应在 BI0-RADPTC-200 型 PCR 仪上进行，其程序为 95°C变性 5min;再 94°C 30s, 58 °C 30s， 72°C 2min，共30个循环；然后72°C延伸IOmin ；4°C保存。PCR产物回收后经链接PMD19-T 载体(TaKaRa)、转化大肠杆菌DH5ci、蓝白斑筛选、摇菌、测序、序列分析，结果表明PCR产物具有序列表中SEQ ID NO. 1的核苷酸序列，命名为GmGMPl基因。实施例2GmGMPl基因植物表达载体pBI_GmGMPl的构建和鉴定将pBI121质粒(购自北京拜尔迪生物技术有限公司)分别经过^Cba I、BamH I 单酶切，用核酸共沉剂DNAmate沉淀回收酶切后的pBI121线性质粒。将测序正确的含有 GmGMPl基因的大肠杆菌进行PCR扩增(上游引物F含有)(baI的酶切位点5’ -GCTCTAGACACATCACAATGAAGGCATTG-3’ (SEQ ID NO. 5)，下游引物 R 含有 BamHI 的酶切位点5，-CGGGATCCTGACCTCACTCACATGACAAT-3，(SEQ ID NO. 6)，对扩增产物胶回收后进行)(ba I、BamH I双酶切得到含)(ba I/BamH I酶切位点的GmGMPl，将酶切产物含)(ba I、BamH I酶切位点的GmGMPl与酶切后的pBI121线性质粒连接，并转化大肠杆菌DH5 α。 蓝白斑筛选及PCR检测得到阳性克隆，命名为pBI-GmGMPl。用限制性内切酶)(ba I/BamH I 双酶切PBI-GmGMPl得到1，IOObp左右的条带，与预期的值相符，所以确认所构建的载体是正确的，即得到了由CaMV35S启动子驱动的GmGMPl基因的表达载体pBI-GmGMPl，载体构造如图2所示。实施例3转GmGMPl基因拟南芥阳性植株的获得以及功能验证本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种大豆ＧＤＰ－Ｄ－甘露糖焦磷酸化酶，其特征在于具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邢邯，薛晨晨，王灿，赵晋铭，郭娜，徐筋燕，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84
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