本发明专利技术公开了一种结核杆菌耐药蛋白的筛选方法，包括以下步骤：(1)选取对药物具有耐药性和/或敏感性的结核杆菌菌株；所述的药物为异烟肼、链霉素、利福平、乙胺丁醇中的一种或多种；(2)将结核杆菌菌株于100℃沸水煮10分钟，灭活，收集菌液，冻于-80℃备用；(3)从菌液中提取蛋白，采用凝胶电泳法分离蛋白，进行胶内酶解，对蛋白测序后提取肽段；(4)将肽段采用液相色谱分离后进行质谱分析，将质谱结果与现有的蛋白质谱数据进行对比分析，筛选出结核杆菌耐药蛋白。本发明专利技术方法能够全面筛选对目前常用结核病用药具有耐药性的结核杆菌耐药蛋白，对研究治疗肺炎、结核病等因结核杆菌导致的疾病的新型药物具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及耐药蛋白的筛选领域，具体涉及一种。
技术介绍
结核分枝杆菌(M. tuberculosis)简称为结核杆菌(tubercle bacilli)。早在 1882年，德国细菌学家郭霍(Robert Koch, 1843-1910)就已证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。20世纪80年代后，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人口流动等因素，全球范围内结核病的疫情骤然恶化。据WHO统计，全世界约每3个人中就有1个人感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成人中结核分枝杆菌携带率高达80%，其中约5% 10%携带者可发展为活动性结核病。近二十年由于艾滋病的流行，感染了 HIV的结核分枝杆菌携带者，由于病毒破坏了机体的免疫功能，发展为活动性结核病的可能性比未感染HIV 者高30 50倍，且结核的病程发展更快。此外，在HIV感染的发展进程中，结核是最早发生的一种机会性感染，结核病加重了 HIV感染者或艾滋病人的疾病负担，使其更易死亡。目前全球每年约出现8百万结核新病例，并导致约3百万人死亡。我国每年死于结核病的人约25万之多，是各类传染病死亡人数总和的两倍多。因此，结核病又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题，并成为某些发展中国家和地区，特别是艾滋病高发区人群的首要死因。在固体培养基中对常用的含异烟胼lg、链霉素10g、利福平50g能生长的结核杆菌为结核杆菌耐药菌，不能生长的结核杆菌为结核杆菌敏感菌。耐药菌株毒力有所减弱。异烟胼可影响细胞壁中分枝菌酸的合成，诱导结核杆菌成为L型，此可能是其耐异烟胼的一种原因。药物敏感试验表明对异烟胼耐药，而对利福平和链霉素大多仍敏感。故目前治疗多主张异烟胼和利福平或吡嗪酰胺联合用药，以减少耐药性的产生，增强疗效。如能筛选出对目前治疗肺炎和结核病的常用药物异烟胼(INH)、链霉素(SM)、利福平(RFP)和乙胺丁醇(EMB)具有耐药性的结核杆菌耐药菌株的耐药蛋白，将能迅速寻找病原菌的致病因子，研究相应的新型药物，降低药物的耐药性，提高病人的痊愈率。
技术实现思路
本专利技术提供了一种，能够全面筛选对目前常用结核病用药具有耐药性的结核杆菌耐药蛋白。一种，包括以下步骤(1)选取对药物具有耐药性和/或敏感性的结核杆菌菌株；所述的药物为异烟胼、链霉素、利福平、乙胺丁醇中的一种或多种；(2)将结核杆菌菌株于100°C沸水煮10分钟，灭活，收集菌液，冻于_80°C备用；(3)从菌液中提取蛋白，采用凝胶电泳法分离蛋白，进行胶内酶解，对蛋白测序后提取肽段；(4)将肽段采用液相色谱分离后进行质谱分析，将质谱结果与现有的蛋白质谱数据进行对比分析，筛选出结核杆菌耐药蛋白。步骤(1)中，选取对药物具有耐药性和/或敏感性的结核杆菌菌株的方法，可采用现有的加药培养方法进行培养得到。为了达到更好的专利技术效果，优选步骤(3)中，所述的凝胶电泳法为十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (SDS-PAGE凝胶电泳法)。步骤(3)中，所述的胶内酶解的方法包括步骤将凝胶电泳法所得的蛋白胶带从上到下根据蛋白情况切成若干个条带，再剪成胶粒，200ml脱色液完全脱至无色，分离所得胶粒使用终浓度为50mmol/L的三羧乙基磷水溶液在60°C水浴还原10分钟，再进行半胱氨酸烷基化使用吲哚-3-乙酸避光条件室温孵育1 小时，分离所得胶粒加200ul脱色液洗两次，每次15分钟，然后往胶粒中加入50ul乙腈，室温放置15分钟，弃去乙腈，离心旋干，旋干后的胶粒加入IOul测序级胰蛋白酶溶液，胶粒在测序级胰蛋白酶溶液中室温孵育15分钟，加入20ul的25mmol/LNH4HC03缓冲液，37°C水浴中振荡过夜，酶解18小时以上，胰酶酶解后的胶粒每次加入50ul肽段提取液，室温孵育30 分钟，提取肽段，重复3次，将提取的肽段溶液合并，离心旋干，干粉在-80°C保存备用。所述的脱色液为乙腈-碳酸氢铵水溶液，其中乙腈体积百分浓度为50 %，碳酸氢铵浓度为25mmol/L。所述的测序级胰蛋白酶溶液的配制方法为胰蛋白酶用25mmol/LNH4HC03缓冲液溶解，配制成胰蛋白酶浓度为lug/ul的母液，使用时按照胰蛋白酶与蛋白质量比为1 50， 用25mmol/L NH4HCO3缓冲液稀释至所需的浓度。所述的肽段提取液为乙腈体积百分浓度为50%和甲酸体积百分浓度为5%的乙腈-甲酸水溶液。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点本专利技术方法能够全面筛选对目前常用结核病用药具有耐药性的结核杆菌耐药蛋白，对研究治疗肺炎、结核病等因结核杆菌导致的疾病的新型药物具有重要的意义。附图说明图1为理想的蛋白SDS-PAGE图；图2为本专利技术结核杆菌样品的蛋白SDS-PAGE图。具体实施例方式实施例11.仪器与试剂Ettan多维液相色谱仪(Ettan MDLC System)购自美国通用公司(GE Healthcare, Pittsburgh, PA USA)。液相色谱iTrap柱和纳升级反向色谱柱(Nanocolumn)是实验室自行填充的，trap柱填料C18AQ为Michrom Bioresouces, Inc公司产品(货号为 PM5/61200/00)，5 μ m，200A，先用5um硅填充至柱头，火烧使硅熔化堵住，再将填料填充成 15X0. Imm I. D.柱。纳升级反向色谱柱填料C18AQ为Michrom Bioresouces, he公司产品(货号为PM5/61100/00)，5 μ m，200人，先将石英毛细管头烧拉成尖状，然后将头部切平， 再将填料填充成15X0. 075mm I. D.柱。LTQ-Orbitrap质谱仪为美国热电公司产品(Thermo Finnigan，Bremen，Germany)， 配有纳升级电喷雾电离源。S peedvac Labconco Centrivap Concentrator 貞空离^已、干!^l系 充为 Lab conco 产品(Labconco, Kansas City, MO USA)。装有Ultracel-3超滤膜的Amicon Ultra-15超滤管购自Millipore公司 (Millipore Inc. , USA) 实验用水均为电阻率为18. 2MQ. cm的超纯水，由ELGA Labffater纯化系统(High Wycombe, UK)纯化得到。HPLC 级乙腈购自 Burdick&Jackson 公司(SK Chemie, Ulson, Korea) 碳酸氢铵购自 FLUKA 公司(Sigma-Aaldrich Chemic GmbH，Japan)。蛋白酶抑制剂混合物(Protease inhibitors cocktail)购自罗氏公司(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)。三羧乙基磷(TCEP)、考马斯亮蓝G-250和碘乙酰胺(IAA)购自Sigma公司(Sigma-Aldrich， St. Louis, MO, USA) ο SDS、超纯级丙烯酰胺及双丙烯酰胺均购自Bio 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种结核杆菌耐药蛋白的筛选方法，包括以下步骤：（１）选取对药物具有耐药性和／或敏感性的结核杆菌菌株；所述的药物为异烟肼、链霉素、利福平、乙胺丁醇中的一种或多种；（２）将结核杆菌菌株于１００℃沸水煮１０分钟，灭活，收集菌液，冻于－８０℃备用；（３）从菌液中提取蛋白，采用凝胶电泳法分离蛋白，进行胶内酶解，对蛋白测序后提取肽段；（４）将肽段采用液相色谱分离后进行质谱分析，将质谱结果与现有的蛋白数据库进行对比分析，筛选出结核杆菌耐药蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张华蓉，林标扬，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86
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