结核分歧杆菌复合群的免疫检出方法技术

通过在生物样品中特异性检出结核分歧杆菌复合群特异性分泌蛋白ＭＰＴ６４抗原，来比以前更快速、安全和准确地进行结核分歧杆菌感染的诊断。获得识别位于ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯＳ：２－４的任一氨基酸序列的ＭＰＢ６４的抗原表位的抗体，特别是单克隆抗体。因此，提供使用该抗体的免疫测定方法，特别是使用抗ＭＰＢ６４的第一抗体和第二抗体的夹心免疫测定方法，特别是免疫色谱测定方法和免疫色谱测试条。试样在未经生物样品培养或短暂生物样品培养（其中样品中的结核分歧杆菌复合群未实质上增殖）后的情况下，能够快速地进行试样的免疫测定。生物样品可以通过结核分歧杆菌的灭活处理或者分散或增溶化处理来进行预处理。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用结核分歧杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex) 特异性分泌蛋白MPB64的抗体的免疫检出方法，并且更具体地涉及夹心免疫测定方法，特 别是免疫色谱测定方法和免疫色谱测试条(test strip)。本专利技术涉及检出方法，该方法对 于通过高灵敏度特异地检出结核分歧杆菌复合群来快速、安全和高准度诊断结核分歧杆菌 复合群感染是有用的。
技术介绍
MPB64是由牛分歧杆菌BCG (Mycobacterium bovis BCG)产生并分泌到细菌细胞外 的分枝杆菌蛋白。另外，MPT64作为由结核分歧杆菌特异性产生并分泌到细菌细胞外的分 枝杆菌蛋白之一为人们所知。已知MPT64是与MPB64相同的物质。这意味着MPB64的抗体 也是MPT64的抗体。因此，通过培养病原性无害牛分歧杆菌BCG、提取并纯化培养物中产生的MPB64， 利用MPB64作为抗原获得抗MPB64抗体，并使用该抗体通过抗原-抗体反应(免疫反应) 检出样品中的MPT64，能够诊断结核分歧杆菌复合群感染。已知有利用MPB64的抗体(以下，简写为“抗MPB64抗体”)通过免疫方法检出结 核分歧杆菌的方法(参见专利文献1)。另外，作为免疫方法还已知使用免疫色谱的测定方 法(参见专利文献2)。然而，这些已知方法需要在进行免疫测定前，通过培养来增殖样品中的结核分歧 杆菌复合群以分泌MPT64，该培养需要大约一周。另外，即使常规免疫色谱方法与大多数非结核性分枝杆菌(NTB)没有反应性，只 与结核分歧杆菌复合群具有非常强的反应性，已报道它们仍显示与两株非结核性分枝杆菌 艮口，海分歧杆菌(Mycobacterium marinum)禾口苦参分歧杆菌(Mycobacterium flavescens) 的交叉反应性(非专利文献1)。专利文献1 日本专利特开平07-110332专利文献2 日本专利特开平11-108931非专禾丨J文献 1 =ABE C.等，"Simple and Rapid Identification of the Mycobacterium tuberculosis Complex by Immunochromatographic Assay Using Anti-MPB64 Monoclonal Antibodies", Journal of Clinical Microbiology, 1999 11 月，第 3693-3697 页。
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的目的是特异性检出生物试样中的MPT64抗原，从而能够以比以前更高的 准确度进行结核分歧杆菌复合群感染的诊断。另外，本专利技术另外的目的是以高灵敏度检出生物试样中的MPT64抗原，从而在未经培养或在样品中的结核分歧杆菌复合群细菌实质上开始增殖之前培养一段时间后的情 况下，能够对生物试样进行免疫测定，并能够比以前更快速和安全地进行结核分歧杆菌复 合群感染的诊断。用于解决问题的方案本专利技术人通过将MPB64作为免疫原免疫小鼠，已成功获得MPB64的特异性抗原表 位的抗体，并发现在免疫测定，特别在夹心免疫测定，尤其在免疫色谱测定中，使用上述抗 体能够更特异地以比以前更高的灵敏度检出结核分歧杆菌复合群。由此，完成了本专利技术。即，根据本专利技术的一方面，提供检出结核分歧杆菌复合群的方法，该方法包括使用 结核分歧杆菌复合群特异性分泌蛋白MPB64的抗体的免疫测定，其中所述抗体包括位于 SEQ IDNOS 2-4的任一氨基酸序列的MPB64抗原表位的抗体。并不特别限定用于本检出方法的免疫测定，但是优选夹心免疫测定法、特别是 ELISA(酶联免疫吸附测定)法和免疫色谱测定法等。因此，根据本专利技术的另一方面，提供检出结核分歧杆菌复合群的方法，该方法包括 使用结核分歧杆菌复合群特异性分泌蛋白MPB64的第一和第二抗体的夹心免疫测定，其中 第一和第二抗体的至少之一包括位于SEQ ID NOS 2-4的任一氨基酸序列的MPB64抗原表 位的抗体。另外，根据本专利技术的优选实施方案，提供用于检出结核分歧杆菌复合群的免疫色 谱测定方法，该方法包括提供膜载体，该膜载体具有在其预定位置通过固定化结核分歧杆菌复合群特异性 分泌蛋白MPB64的第一抗体形成的捕获区(capturing zone)；和在膜载体上向捕获区色谱展开含有MPB64的第二抗体和预定量试样的混合溶液，由此，在捕获区捕获包含于试样的抗原和第二抗体的复合体，并且其中第一和第 二抗体的至少之一包括位于SEQ IDNOS 2-4的任一氨基酸序列的MPB64抗原表位的抗体。另外，根据本专利技术的优选实施方案，提供用于检出结核分歧杆菌复合群的免疫色 谱测试条，该免疫色谱测试条至少包括结核分歧杆菌复合群特异性分泌蛋白MPB64的第一 和第二抗体以及膜载体，其中第一抗体被预先固定化至膜载体的预定位置而形成捕获区， 并且用适当的标记剂来标记和在远离捕获区的位置来制备第二抗体，以便在膜载体中色 谱展开，其中第一和第二抗体的至少之一包括位于SEQ ID NOS :2-4的任一氨基酸序列的 MPB64抗原表位的抗体。本专利技术中必不可少使用的MPB64的抗体是位于SEQ IDNOS 2~4的任一氨基酸序列 的MPB64抗原表位的抗体，可以是多克隆抗体或单克隆抗体，并且从反应特异性角度来说， 优选单克隆抗体。同时，SEQ ID NOS :2-4的氨基酸序列构成示于SEQ ID N0:1的MPB64整 个氨基酸序列的部分，并且是包含MPB64抗原表位的区域。在夹心免疫测定如免疫色谱测定的情况中，此处所用的第一和第二抗体可分别是 多克隆或单克隆的，从反应特异性的观点来看，通常优选至少两种抗体之一为单克隆的，并 特别优选两种抗体都是单克隆的。另外，由于MPB64是单体蛋白，所以优选第一和第二抗体 是MPB64不同抗原表位的抗体。本专利技术使用的抗体是位于SEQ ID NOS :2_4的任一氨基酸序列的抗原表位的抗体， 其中SEQ ID NOS 2-4的任一氨基酸序列包含于SEQ ID NO 1所示的MPB64的整个氨基酸序列中，因此，该抗体与MPB64或MPT64特异性反应。另外，本专利技术的这些抗体与非结核性 分枝杆菌(NTB)不反应，并进一步与海分歧杆菌和苦参分歧杆菌不反应，因此特异性优异。 SEQ ID N0S:2-4的氨基酸序列是包含MPB64抗原表位的区域。换言之，本专利技术使用的抗体 可以是与包含SEQ ID NOS 2-4的氨基酸序列之一的具有12-15个氨基酸残基的MPB64片 段进行抗原_抗体反应的抗体。因此，根据本专利技术的另一方面，提供识别位于SEQ IDNOS 2~4的任一氨基酸序列 的MPB64抗原表位的单克隆抗体。专利技术的效果根据本专利技术，将位于SEQ ID NOS :2_4(所述SEQ ID NOS :2_4氨基酸序列包含于 SEQ ID N0:1所示的MPB64的整个氨基酸序列中)的任一氨基酸序列的抗原表位的抗体用 于免疫测定的检出方法中，因此能够以比以前更高的准确度进行结核分歧杆菌复合群感染 的诊断，并且由于在未经培养或在样品中的结核分歧杆菌复合群细菌实质上开始增殖之前 培养一段时间后的情况下，也能将生物样品进行免疫测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检出结核分歧杆菌复合群的方法，其包括利用结核分歧杆菌复合群特异性分泌蛋白ＭＰＢ６４的抗体的免疫测定，其中所述抗体包括位于ＳＥＱＩＤＮＯＳ：２－４的任一氨基酸序列的ＭＰＢ６４的抗原表位的抗体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：难波靖治，
申请(专利权)人：株式会社比尔生命，
类型：发明
国别省市：JP[日本]