一种抗人源多药耐药蛋白Fab抗体及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种抗人源多药耐药蛋白Fab抗体及其制备方法，属于抗体及其制备领域；本发明专利技术为取多药耐药性大肠癌病理组织总RNA并逆转录为cDNA，利用本实验室设计的特异性引物扩增出P-gp跨膜区（氨基酸784～968）基因片段，克隆至pET28a（+）载体并转化E.coliBL21（DE3），IPTG，30℃诱导表达，表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后WesternBlot鉴定。将纯化的P-gp784-968蛋白作为抗原，对利用17条重链上游引物和5条重链下游引物；20条轻链上游引物及2条轻链下游引物，用原核表达的P-gp784-968肽段对pComb3载体的P-gpFab抗体库进行五轮淘选，最终淘选所获得的克隆进行双酶切鉴定及IPTG诱导表达，表达产物通过ELISA及WesternBlot鉴定后获得阳性克隆菌株，并测序，得PFab29。本发明专利技术为制备抑制肿瘤多药耐药的药物提供可能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于Fab抗体及其制备领域,特别涉及一种抗多药耐药蛋白Fab抗体及其制备方法。
技术介绍
肿瘤细胞的多药耐药性(mult1-drug resistance, MDR)多为获得性耐药，即在治疗前对药物敏感，治疗后对药物耐受。多药耐药性是指不仅对使用药物产生耐受，而且对其他多种结构和作用机制完全不同的药物产生交叉耐受。肿瘤细胞产生多药耐药性的最主要原因是瘤细胞膜过量表达一种ATP依赖性外排性泵，以减少化疗药物在细胞内部的积累。这种ATP依赖性外排性泵属于ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白超家族,主要包括以下几种(I)肿瘤多药耐药蛋白Ι/P-糖蛋白即为P-gp (Mult1-Drug Resistancel/ P-glycoprotein, MDRl/P-gp)也称为 ABCBl (ATP-binding cassette BI)，它是 1976 年 Juliano等在耐药的中国仓鼠卵巢癌细胞中发现的，随后Roninson等获得人耐药KB癌细胞株的MDRl基因序列[1]，P-gp也是现在引起肿瘤多药耐药性最常见的原因。(2)多药耐药相关蛋白(3)乳癌耐药本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗人源多药耐药蛋白Fab抗体，其特征在于：基因全序列见序列表SEQ?ID?No.1，3。

【技术特征摘要】
1.一种抗人源多药耐药蛋白Fab抗体，其特征在于基因全序列见序列表SEQ ID No. 1,3。2.如权利要求1所述的序列，其特征在于轻链基因的序列全长为635bp，序列见序列表 SEQ ID No.1。3.如权利要求2所述的序列，其特征在于轻链基因所编码的多肽为211个氨基酸，见序列表 SEQ ID No. 2。4.如权利要求1所述的序列，其特征在于重链基因的序列全长为696bp，序列见序列表 SEQ ID No. 3。5.如权利要求4所述的序列，其特征在于重链链基因所编码的多肽为232个氨基酸， 见序列表SEQ ID No. 4ο6.—种权利要求1所述的抗人源多药耐药蛋白Fab抗体的制备方法如下(1)提取多药耐药人大肠癌组织总RNA并反转录为cDNA，设计引物，序列如下Sense primer CCGGAATTCCTCACCAAGCGGCTCCGAT ；Ant1-sense primer CCGCTCGAGGAGTTTATGTGCCACCAAGTAG ；上游(5'端)引物引入EcoR I酶切位点，下游(3'端)引物引入Xho I酶切位点，合成引物，利用设计引物PCR扩增目的基因片段JfpET28a(+)载体和P_gp784_968目的基因分别进行Xho I和EcoR I双酶切，然后凝胶回收并定量；(2)pET28a(+)载体与P_gp784_968目的基因连接，热激转化BL21(DE3)感受态细胞涂布 LB/Kan (卡那霉素)平板，培养，提取质粒，然后进行Xho1、EcoR I双酶切鉴定，选择酶切结果阳性的克隆，测序，见序列表SEQ ID No. 5的序列；(3)取鉴定正确的阳性克隆P_gp784_968菌液，于LB/Kan液体培养基中培养，加入IPTG诱导表达，纯化，得P_gP784-968蛋白，见序列表SEQ ID No. 6的序列，备用；(4)另取多药耐药性大肠癌病理组织，免疫小鼠，利用酶联免疫吸附法(ELISA)测定抗体滴度抗体滴度大...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学梅，张海玉，王清，李俊，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：