一种无标签结核融合蛋白TB10-TB8制造技术

本发明专利技术涉及一种无标签结核融合蛋白TB10-TB8，利用基因工程技术，将结核分枝杆菌的基因TB10.4和TB8.4进行重组融合，构建重组质粒pET30a-TB10.4-TB8.4，进行诱导表达，获得重组基因的表达物，最后将重组基因表达物进行纯化，克隆构建了不带有任何标签的结核分枝杆菌融合蛋白TB10.4-TB8.4。本发明专利技术的优点在于：解决了融合蛋白所带有的标签会影响到动物实验以及更进一步的临床学试验的后续问题，并且通过利用不同的色谱分析方法使融合蛋白得到了有效的纯化，有望成为结核病预防的候选疫苗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因工程重组蛋白，具体地说是一种无标签结核融合蛋 TB10-TB8，属于疫苗制造

技术介绍
结核病是长期危害人类健康的严重疾病之一，全世界仍有近1/3的人感染过结核分枝杆菌，大约有5%的结核感染者在2-5年内会发展为肺结核病人，其余的有可能会形成结核病的潜伏感染者。我国是结核病高负担的国家之一，每年约有13万人因结核病而死亡。目前，卡介苗(BCG)的接种是有效预防结核病的重要措施。然而，不同研究显示， BCG在不同人群中的保护性不稳定，尤其是对成人肺结核的保护效率介于0-80%不等。因此，研制和开发全面高效的抗结核疫苗是控制结核病的重要途径。可供研究的抗结核疫苗有亚单位疫苗，重组BCG，减毒的结核分枝杆菌(MTB)活疫苗。亚单位疫苗又包括蛋白疫苗，DNA疫苗和以病毒为载体的疫苗；其中的蛋白疫苗具有成分明确，使用安全等优点，相对易于被人们接受。大量研究表明，与单个抗原相比，融合抗原的免疫原性会增强，显示出更好的保护效果；因此受到国内外研究的重视。然而在以往的研究中，为了后期简便的纯化方法，往往构建成带有各种标签(如His · Tag, GST · Tag, S · Tag等)形式的融合蛋白，却未考虑这种融合蛋白所带有的标签是否会影响到动物实验以及更进一步的临床学试验的认可。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，针对上述为了后期简便的纯化方法，而构建带有各种标签形式的融合蛋白问题，本专利技术通过基因重组、表达方法，提供了一种不带有标签的结核分枝杆菌融合蛋白TB10. 4-TB8. 4，为预防和控制结核病提供有效的亚单位疫苗。抗原TB10. 4是早期分泌蛋白ESAT-6家族中的一员(ESAT-6，CFP-10, TB10. 4， TB10.3，etc)，且与ESAT-6相比，TB10. 4能在BCG接种人群中引起强烈反应，尤其是结核感染者中反应更强。其次，低分子质量蛋白TB8. 4是一种与结核分枝杆菌潜伏感染相关的重要抗原， 能诱导强烈的体液免疫反应，产生高水平的IgGl和IgGh，能诱导C57BL/ 6小鼠产生强烈的TB8. 4特异性Thl型细胞免疫反应，分泌高水平的IFN- Y，产生对感染细胞有强溶解能力的细胞毒性T细胞(CTL)，减少免疫鼠脾脏和肺中的细菌载量，保护小鼠抵御毒性结核分枝杆菌的攻击。本专利技术的技术方案为一种无标签结核融合蛋白TB10-TB8，其由以下步骤制备而成(1)将结核分枝杆菌的基因TB10.4和TB8. 4进行重组融合，构建重组质粒；(2)将上述步骤(1)中制备的质粒进行转化，挑选阳性克隆进行诱导表达，获得重组基3因的表达物；(3)对上述步骤(2)中的重组基因表达物进行纯化。所述的步骤(1)的重组质粒的构建方法为根据GenBank中H37Rv中的TB10. 4和 TB8. 4的基因序列，应用分子克隆技术设计含有不同酶切位点的TB10. 4引物和TB8. 4引物， 以H37RV-DNA为模板PCR扩增出相应大小的基因片段，通过双酶切和T4连接酶的作用将扩增的基因片段连接，将连接产物转化入大肠杆菌克隆载体。所述的连接产物转化入大肠杆菌克隆载体后，挑选阳性克隆进行PCR验证并测序，测序结果见SEQ ID NO :1，测序正确的重组质粒再次转化入大肠杆菌表达载体。PCR扩增获得的TB10. 4和TB8. 4序列与GenBank中完全一致，二者融合后在大肠杆菌中表达产物大小约19KD，与预计大小相吻合。所述的步骤(2)的诱导表达方法为将步骤(1)中获得的含有重组质粒的表达载体接入含有卡那霉素的LB液体培养基中，35 40°C振荡培养10 14小时；再将Iml的该菌液移入IOOml的LB液体培养基中，35 40°C振荡培养2 4小时，至吸光度A600值为 0. 6 0. 8，诱导振荡培养6 他后，离心，收集菌体。所述的步骤(3)的融合基因以上清液表达为主，采用离子交换层析和疏水层析的两种色谱分析方法进行最终的蛋白纯化。一种无标签结核融合蛋白TB10. 4-TB8. 4，其特征在于作为用于制备结核病疫苗的抗原。本专利技术的优点在于利用基因工程技术，克隆构建了不带有任何标签的结核分枝杆菌融合蛋白TB10. 4-TB8. 4，解决了融合蛋白所带有的标签会影响到动物实验以及更进一步的临床学试验的后续问题，并且通过利用不同的色谱分析方法使融合蛋白得到了有效的纯化，有望成为结核病预防的候选疫苗。附图说明图1结核分枝杆菌基因TB10. 4与TB8. 4体外扩增图谱； 图2重组质粒pET30a-TB10. 4的鉴定图谱；图3重组质粒pET30a-TB10. 4与基因TB8. 4的连接图谱； 图4融合基因TB10.4-TB8.4的表达结果图谱；图5无标签结核分枝杆菌融合蛋白TB10. 4-TB8. 4第一步纯化即离子交换层析图； 图6无标签结核分枝杆菌融合蛋白TB10. 4-TB8. 4第二步纯化即疏水层析图； 图7无标签结核分枝杆菌融合蛋白TB10. 4-TB8. 4的纯化结果图谱； 图3中1双酶切以及纯化的基因TB8. 4、2双酶切以及纯化的质粒pET30a-TB10. 4、3未酶切的质粒 pET30a-TB10. 4、M Marker ；图 4 中1 Marker,2 BL21 空菌上清、3 BL21 空菌沉淀、4 TB10. 4-TB8. 4 上清、5 TB10. 4-TB8. 4 沉淀；图 7 中1 Marker,2 纯化前的 TB10. 4-TB8. 4、3 第一步纯化后的 TB10. 4-TB8. 4、4 第二步纯化后的TB10. 4-TB8. 4 ；SEQ ID NO: 1 融合基因TB10. 4-TB8. 4的DNA测序结果(注GAATTC为EcoR I的酶切位点)。具体实施例方式以下对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例一重组质粒pET30a-TB10. 4-TB8. 4的克隆构建1、主要材料结核分枝杆菌株H37Rv来自甘肃省疾病控制中心；质粒pET30a、Ε. coli DH5a与BL21(DE3)由复旦大学王洪海教授惠赠；引物由上海生物生工工程有限公司合成； 基因测序由北京华大基因科技完成；PCR试剂盒、产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒购自大连宝生物有限公司；基因组提取试剂盒、DNA Marker III购自兰州市鹏程生物有限公司；质粒提取试剂盒、T4 DNA连接酶、限制性内切酶I ,Η η lll,Nde I购自上海生物生工工程有限公司。2、主要仪器高压蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司);超低温冰箱-80°C (USA 813283-1048)；艾科浦超纯水机AFZ0502U (重庆颐洋科技有限公司)；超净工作台(苏州净化)；东盛龙PCR仪；DYY12电泳仪及水平电泳槽(北京六一仪器厂)；IF258全自动凝胶成像分析系统(上海嘉鹏科技有限公司)；电子天平BT124S ；电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；Beckman低温高速离心机 (USA) ； JB3型定时恒温磁力搅拌器(上海雷磁新径仪器有限公司)；PH仪(PB-16) ；DK80电热恒温本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种无标签结核融合蛋白ＴＢ１０－ＴＢ８，其特征在于由以下步骤制备而成：（１）将结核分枝杆菌的基因ＴＢ１０．４和ＴＢ８．４进行重组融合，构建重组质粒；（２）将上述步骤（１）中制备的质粒进行转化，挑选阳性克隆进行诱导表达，获得重组基因的表达物；（３）对上述步骤（２）中的重组基因表达物进行纯化。

【技术特征摘要】
1.一种无标签结核融合蛋白TB10-TB8，其特征在于由以下步骤制备而成(1)将结核分枝杆菌的基因TBio.4和TB8. 4进行重组融合，构建重组质粒；(2)将上述步骤(1)中制备的质粒进行转化，挑选阳性克隆进行诱导表达，获得重组基因的表达物；(3)对上述步骤(2)中的重组基因表达物进行纯化。2.根据权利要求1所述的一种无标签结核融合蛋白TB10-TB8，其特征在于所述的步骤(1)的重组质粒的构建方法为根据GenBank中H37Rv中的TB10.4和TB8. 4的基因序列，应用分子克隆技术设计含有不同酶切位点的TB10. 4引物和TB8. 4引物，以H37Rv_DNA为模板 PCR扩增出相应大小的基因片段，通过双酶切和T4连接酶的作用将扩增的基因片段连接， 将连接产物转化入大肠杆菌克隆载体。3.根据权利要求2所述的一种无标签结核融合蛋白TB10-TB8，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝秉东，章国平，胡丽娜，王秉翔，达泽蛟，高娃，张颖，万艳，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：62