过滤型蛋白芯片制造技术

本发明专利技术提出一种新型的过滤型蛋白芯片技术。该芯片包括多孔纤维素过滤载体，和由多个对待分析物具有特异性的捕获分子在该载体表面上形成的微阵列。捕获分子可以是蛋白（包括单克隆或多克隆抗体、抗原或其它蛋白）、适合体或其它小分子。此外，本发明专利技术还包括同时使用多个叠放的微阵列芯片检测待分析物的装置和实验方法。总之，过滤型蛋白芯片是一种更灵敏、更特异、更定量、更快捷以及更高通量的新型技术，可以用于对疾病的多分子联检等诸多应用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及在生物样品中检测特异性蛋白的系统组成和实验方法。具体说，是使用捕获分子组成的微阵列来实现高通量待分析样品的检测，例如对疾病具有特异性的蛋白分子。
技术介绍
作为一个新兴的生命科学领域，蛋白组学建立在基因组研究的基础上，又是后者的重要发展。蛋白组是一个基因组的所有编码蛋白，蛋白组学则是“在蛋白水平上研究基因表达，以深入研究生命过程(例如，疾病机理及药物效用)并解码基因表达的控制规律”。基因组学已经提供了人们关于基因表达与调控对一些疾病和药物治疗的影响的初步知识。新兴的技术包括基因表达序列分析(SAGE)和基因芯片(已大规模商业化)，已经大幅度促进了基因组研究。例如，由艾菲矩阵公司(Affymetrix)所生产的基因芯片(GeneChip)，可同时检测一组基因的表达水平的变化。使用这一技术，在表面合成一组对应于感兴趣的基因的核酸探针，使之形成一微阵列。样品中的信使核糖核酸(mRNA)在反转录，括增及荧光标记后，与微阵列中的对应探针分子结合。使用这一技术，可以检测到最少2倍的信使核糖核酸表达水平变化。基因芯片得到的基因表达水平数据可以用来生成对应于不同表型或生理状态的基因表达数据库。但是，基因芯片不能用来研究蛋白的表达，而由于翻译后调控和修饰，蛋白表达和基因表达往往有本质的不同。蛋白在建立生命表型的过程中起到核心的作用。因此，与反映基因水平的的信使核糖核酸相比，蛋白更直接地显示生命的功能。尽管信使核糖核酸表达水平与蛋白表达水平相关，研究表明，由于不同的信使核糖核酸剪接方式和其它调控机理，这一相关性并不密切。此外，基因组研究不可能提供对于生命状态举足轻重的翻译后修饰的任何信息。目前，大量的蛋白组研究依赖于聚丙烯酰胺双向电泳技术(2DPAGE)。根据不同的蛋白分子量和等电点，样品(来源于细胞或组织裂解液，或体液)中的蛋白可以在胶质中被分离。染色成像后经数据处理，对不同样品中蛋白表达水平的增减即可以做半定量研究。例如，对照疾病和正常生理状态，以及比较药物作用前后的蛋白表达。传统上，双向电泳所分离的蛋白可以进一步由艾德曼(Edman)方法分析氨基酸序列。近年来，更多地应用质谱技术来进行未知蛋白的高通量分析研究。但是，双向电泳技术本身需要花费大量的时间。而且，质谱技术需要昂贵的专门化设备，限制了它的临床应用。在临床上广泛应用的固相蛋白免疫技术，如酶联免疫技术、荧光免疫技术和放射性免疫技术，都很难应用于高通量蛋白组研究。上世纪八十年代以来扩散限制的固相免疫反应受到了广泛的研究。为加速酶联免疫技术的反应动力学，人们创造了一种新型的酶联过滤免疫技术(ELIFA，www.皮尔斯.c皮摩尔/files/ACF15B.pdf)。但是，酶联过滤免疫技术是一种依赖于多孔板的低通量的技术，只能在多孔板每个孔槽中固定一种捕获分子，因此其实验效率受制于孔槽的数目。进一步说，酶联过滤免疫技术所需要的抗体和样品量也不能满足微量分析的需要。新兴的蛋白芯片，即蛋白微阵列技术，可以避免这些传统技术的缺点。芯片技术是一种崭新而有效的高通量蛋白组研究工具，可研究蛋白表达、蛋白间相互作用以及酶活性。目前大多数蛋白芯片技术是基于固定在表面上的捕获分子与样品溶液中的待分析蛋白的反应。简单说，一系列的捕获分子，例如抗体，先被打印到表面上以形成一微阵列。然后，少量的标记后的蛋白样品被加到微阵列表面上。经过一段时间的振荡混合及反应，待分析物结合到它们对应的捕获分子上。这些反应可以通过每个捕获分子微点的荧光信号来检测，其信号强度直接反映待分析物浓度、数量及其与捕获分子的亲合力。因为一个微阵列可以包括很多种不同的捕获分子，它就可以同时检测多种待分析蛋白的表达和蛋白间的相互作用。麦克白(Macbeath)和和施莱伯(Schreiber)第一次展示了应用蛋白芯片技术进行高通量蛋白相互作用研究的巨大潜力。在他们的一个实验中，两种捕获分子G蛋白(Protein G)和普乐可复结合蛋白-结合蛋白(FRB)分别在一片载玻片上打印了10799次和1次。然后，该芯片同花菁5标记的普乐可复结合蛋白反应，他们发现只有普乐可复结合蛋白-结合蛋白微点有信号，表明普乐可复结合蛋白(FKBP12)被普乐可复结合蛋白-结合蛋白特异地检测到。在另一实验中，三种不同捕获分子被打印到表面上，包括抗地高辛(Anti-DIG)、链菌素(Streptavidin)和普乐可复结合蛋白。然后，将生成的芯片与牛血白蛋白-地高辛-艾力克萨488牛血白蛋白-生物素-花菁5(BSA-DIG-Alexa488 BSA-Biotin-CY5)和牛血白蛋白-六氢吡喧酮胺-花菁3(BSA-AP1497-Cy3)分别反应，发现只有每种待分析物对应的捕获蛋白微点才有荧光信号。此外，如果与上述三种待分析物蛋白的混合物反应，则所有微点都表现出荧光信号。这一实验进一步证明了蛋白微阵列可以同时特异性地检测多种待分析物。一些近期的研究结果进一步表现了蛋白芯片技术的有效性。但是，大多数的蛋白芯片设计多仿照于基因微阵列的设计，即，捕获分子打印在载玻片上，反应通过振荡完成。这一方法对蛋白组研究实际上并不适合，主要因为固相蛋白反应受到严重的扩散限制，而通常所用的基因芯片材料则不适合固定蛋白捕获分子。具体来说，固定在表面上的微阵列与待分析物之间的反应极度依赖于振荡混合，而后者的效率往往受限制于待分析物分子在固-液界面的边界层中的缓慢扩散过程。因为蛋白不能象DNA一样被括增，边界层中少量的蛋白极容易被消耗尽，因此扩散过程对蛋白芯片反应的限制程度远比对基因芯片技术的限制严重。另一方面，由于蛋白和核酸在物理化学性质上本质的不同，玻璃表面不适合固定蛋白分子。核酸分子是一维的线性结构，而蛋白的构像是三维的，而且任何相对于蛋白自然构像的偏差都可能影响蛋白的正常功能。因此，目前的蛋白芯片设计中存在抗体在打印到表面后改变构像和活性的问题。另一方面，DNA之间的相互作用较蛋白相互作用要更强和更为特异。DNA相互作用是通过一系列的碱基配对完成的，可以保证很高的结合力和特异性。而蛋白相互作用往往是小范围内的作用。因此，为达到一定的信号强度，蛋白芯片要求高的待分析物浓度，或者表面上大量的捕获分子。因为蛋白样品不能被括增，所以只有后一方案可行。而常用的玻璃表面达不到这一要求。然而，表面高浓度的捕获分子不可避免地导致扩散限制的缓慢的反应动力。为消除扩散限制的影响，人们尝试了不同的方法。纳米基因公司(Nanogene)运用定向电泳技术来加速DNA芯片的反应，即，使待分析DNA分子在电场作用下向固定的探针运动以加速反应。但是，蛋白的电性质远比DNA复杂，它们可能会在所加电场下向不同的方向以不同的速度运动。近来基因逻辑公司(Genelogics)发展了一种过滤型基因芯片技术基因探针固定在活化了的多孔硅片上以形成芯片，待分析DNA分子标记后滤过芯片，并与其上的基因探针分子反应。这一通过对流而不是扩散的方法可以大幅度加速反应过程。而且，多孔硅片具有较大的表面积，可以固定更多的探针分子以进一步提高信号强度。另一类似的设计是梅特基因公司(MetriGenix)的4维DNA芯片。但是，硅片需要预先进行化学处理活化后才可以结合蛋白，而且其活化层往往不稳定。
技术实现思路
本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个包含以下内容的过滤型芯片系统：ａ．由方向随机分布的纤维素纤维形成的多孔过滤载体；ｂ．多个对待分析物具有特异性的捕获分子在该载体表面上形成的微阵列；ｃ．运用机电系统，使含有待分析物的样品流过该微阵列芯片，以便微阵列内的捕获分子能够探测相应的待分析物。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：包刚，许扬清，
申请(专利权)人：包刚，许扬清，
类型：发明
国别省市：US[美国]