本发明专利技术涉及一种定量样品中一种或多种靶核糖核酸的方法，包括以下步骤，（ｉ）提供包含所述一种或多种靶核糖核酸的样品，（ｉｉ）在允许所述染料与所述样品中的一种或多种核糖核酸结合的条件下，使所述样品与核糖核酸特异性荧光染料接触，（ｉｉｉ）检测所述样品中所述ＲＮＡ－结合染料的荧光值，（ｉｖ）将所测得的荧光值与样品中的ＲＮＡ总量相关联，（ｖ）逆转录所述一种或多种核糖核酸，从而产生双链核酸，（ｖｉ）扩增所述一种或多种产生的双链核酸，其中在扩增期间和／或之后，在允许样品中产生的所述一种或多种双链核酸结合所述一种或多种探针的条件下，存在所述一种或多种扩增产物的一种或多种特异性荧光探针，（ｖｉｉ）检测扩增期间和／或之后，结合于所述一种或多种扩增产物的所述一种或多种探针的荧光值，并将所测得的荧光值与样品中靶ＲＮＡ序列的含量相关联，（ｖｉｉｉ）按样品中ＲＮＡ的总量校正样品中靶ＲＮＡ序列的含量。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于生物学与化学领域。具体说，本专利技术属于分子生物学领域。更具体说， 本专利技术属于核酸定量与实时PCR领域。此外，本专利技术涉及经校正的靶核糖核酸定量检测。
技术介绍
核酸混合物中特定靶核糖核酸(本文中也称特定RNAs)的定量检测对分子生物学的许多应用，如基因表达分析、或核酸混合物中特定RNA的纯化至关重要。在定量检测方法中，需确定样品中特定RNA的浓度和/或相对或绝对含量。具体说，对于基因表达分析，例如测定生物样品中的mRNA水平，需要一种可重现和比较的方法。例如，不总是能获得具有相当体积、核酸含量、细胞材料等的生物样品。此外，生物样品中核酸检测和定量的灵敏度和选择性至关重要。为了更好地比较两种或多种不同(生物学)样品中特定RNA的含量或者比较一个样品中两种或多种不同特定RNA的含量，必须把特定RNA的含量按输入核酸或输入核酸中的特定种类为基准进行校正。例如，特定RNA的含量可以通过将这些含量与样品中的内标或全部(即总)核酸量或样品中特定种类核酸的含量相关联而进行校正。对于(生物学)样品中核酸的常规定量，广泛采用了定量(实时)PCR(qPCR)。对于RNA，具体是mRNA，本领域采用定量实时逆转录PCR(RT-qPCR)。已采用不同的方法对定量PCR方法得到的数据进行校正。将特定mRNA的含量按不同的参比基因，例如持家或保持基因如β-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶 (HPRT)基因、或者28S或18S核糖体RNA的一种或多种mRNA的含量进行校正就是其中一种方法。然而，已经发现这些校正基因的表达水平取决于实验条件、样品的制备和来源(如组织或细胞类型)而不同，因此它们不是输入核酸的可靠指示。所以，通常需要在费力易错的过程中测试各种不同的持家基因以鉴定在所研究的样品之间没有变化的那些基因。其它方法有，例如，依靠DNA和/或RNA总量或如核糖体RNA (rRNA)总量进行的校正。由于生物细胞和样品中核糖体RNA的含量同样取决于多种因素而有差异，用rRNA校正也不太优选。本领域现有的依赖于按例如核酸总量、RNA总量或基因组DNA总量进行校正的方法也有局限性，如这些含量变化或核酸样品的质量有所不同。用外来或人造分子如掺入样品(如细胞抽提物或者组织衍生样品)中的体外转录产物进行校正也不总是充分的方案，因为它们不能代表细胞内的核酸(如基因组DNA、RNA、mRNA)含量。此外，为了比较经校正的数据以及实验方案的重现性，需要对所用的实验条件编制详尽的文档。当分别测定或用不同方法测定感兴趣的核酸与校正核酸的含量时，这一点特别相关。因此，本专利技术主要的技术问题是开发和提供一种改进的、特别是较不费力不易错的方法来校正靶核糖核酸的含量。专利技术概述本专利技术涉及一种定量测定样品中一种或多种靶核糖核酸的方法，包括以下步骤(i)提供包含所述一种或多种靶核糖核酸的样品；(ii)在允许所述染料与所述样品中一种或多种核糖核酸结合的条件下，使所述样品与核糖核酸特异性荧光染料接触；(iii)测定所述样品中所述RNA-结合染料的荧光；(iv)将所述测得的荧光与样品中的RNA总量相关联；(ν)逆转录所述一种或多种核糖核酸，从而产生双链核酸；(vi)扩增所述一种或多种产生的双链核酸，其中在扩增期间和/或之后，在允许一种或多种探针与样品中产生的所述一种或多种双链核酸结合的条件下，存在所述一种或多种扩增产物的一种或多种特异性荧光探针；(vii)测定扩增期间和/或之后结合于所述一种或多种扩增产物的所述一种或多种探针的荧光，并把所述测得的荧光与样品中靶RNA序列的量相关联；(viii)按样品中RNA的总量校正样品中靶RNA序列的含量。样品至少含有需定量的核糖核酸的核酸分子。所述核酸可以包含在细胞或者生物体内，但也可以存在于无细胞系统中。样品可以是液体、裂解液、固体基质或其它含有核酸分子的任何物质。在本专利技术中，样品可以是所有生物组织和所有液体如淋巴液、尿液、脑液。 组织可以是，例如上皮组织、结缔组织如骨骼或血液、肌肉组织如内脏或平滑肌和骨骼肌， 以及神经组织。在一种实施方式中，样品是细胞培养物或细胞培养抽提物。本文中，靶核糖核酸可以是任何来源，如病毒、细菌、原始细菌、真菌、核糖体、真核或原核细胞来源。可以来自任何生物学样品和任何生物体、组织、细胞、或亚细胞区室。例如，可以是来自植物、真菌、动物的核酸，特别是人的核酸。在定量之前，可预先处理RNA，如分离、纯化或修饰。也可以定量测定人造RNA。RNA的长度可以不同。可以修饰RNA，例如可含有一种或多种修饰的核苷碱基或修饰的糖基(如含甲氧基团)。在肽核酸(PNA)中，RNA 骨架可含一个或多个肽键。RNA可含碱基类似物如非嘌呤或非嘧啶类似物或者核苷酸类似物。也可含其它附着物如蛋白质、肽和/或氨基酸。本文的“引物”指包含与待转录核酸(“模板”)基本互补序列的寡核苷酸。在复制过程中，聚合酶将各核苷酸加到与模板各对应核苷酸基本互补的引物的3’末端上。本文的“RNA特异性染料”定义如下"RNA特异性染料”的光谱性质不得干扰用来检测靶RNA的光谱性质，允许进行同时检测。用于检测靶RNA的反应混合物含有可能干扰RNA的测定的各种物质，如DNA、核苷酸、寡核苷酸、蛋白质、洗涤剂、盐。因此，所选的RNA特异性染料受这些物质影响的程度必须不会干扰对RNA的定量测定。在上述物质存在时，要求将RNA的浓度与荧光值之间相关连。"RNA特异性染料”可以是能与RNA特异性结合、并且基本上不与样品中通常存在的其它核酸如DNA或其它成分结合的染料。结合后，RNA特异性染料的光谱特性可以改变， 如荧光增强。或者，“RNA特异性染料”也可以是与样品中的核酸非特异性结合的染料，但其光谱特性如荧光仅在与RNA结合时才发生显著改变。因此，"RNA特异性染料”允许选择性检测 RNA而不受样品中通常存在的其它核酸或蛋白质、洗涤剂、盐或其它成分显著干扰。本文的“DNA特异性染料”定义如下“DNA特异性染料”的光谱性质不得干扰用来检测总RNA的染料的光谱性质，允许进行同时检测。“DNA特异性染料”需要对扩增产物有特异性，要么选择对双链DNA有选择性的染料，要么选择对扩增产物序列有选择性的探针。本文的“荧光探针”是DNA特异性染料或者标记了荧光染料的核酸探针。本专利技术的核酸探针是与特定核酸序列基本互补的寡核苷酸、核酸或其片段。RNA特异性染料的光谱性质不同于DNA特异性染料或者荧光染料，因此它们都可以被检出。本专利技术还涉及定量测定样品中靶RNA的试剂盒，其包含，(i)与RNA特异性结合的荧光染料，和(ii) 一种或多种DNA扩增产物的一种或多种特异性荧光探针。本文所用的试剂盒是一种包装组件，任选地包括组件的使用说明和/或用于该用途的其它反应物和组分。本专利技术还涉及RNA特异性荧光染料如Quant-iTTM-RNA在按样品中RNA总量校正样品中靶RNA序列含量中的应用。专利技术详述本专利技术人发现某些染料允许对RNA进行校正。本专利技术涉及一种定量测定样品中一种或多种靶核糖核酸的方法，包括以下步骤(i)提供包含所述一种或多种靶核糖核酸的样品；(ii)在允许所述染料与所述样品中一种或多种核糖核酸结合的条件下，使所述样品与核糖本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．检测样品中一种或多种靶核糖核酸的方法，包括以下步骤：（ｉ）提供包含所述一种或多种靶核糖核酸的样品；（ｉｉ）在允许所述染料与所述样品中一种或多种核糖核酸结合的条件下，使所述样品与核糖核酸特异性荧光染料接触；（ｉｉｉ）测定所述样品中所述ＲＮＡ－结合染料的荧光；（ｉｖ）将所述测得的荧光与样品中的ＲＮＡ总量相关联；（ｖ）逆转录所述一种或多种核糖核酸，从而产生双链核酸；（ｖｉ）扩增所述一种或多种产生的双链核酸，其中在扩增期间和／或之后，在允许一种或多种探针与样品中产生的所述一种或多种双链核酸结合的条件下，存在所述一种或多种扩增产物的一种或多种特异性荧光探针；（ｖｉｉ）测定扩增期间和／或之后结合于所述一种或多种扩增产物的所述一种或多种探针的荧光，并把所述测得的荧光与样品中靶ＲＮＡ序列的量相关联；（ｖｉｉｉ）按样品中ＲＮＡ的总量校正样品中靶ＲＮＡ序列的含量。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：F·纳兹，
申请(专利权)人：恰根有限公司，
类型：发明
国别省市：DE
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