本发明专利技术报导了测定编码免疫球蛋白的ｍＲＮＡ量的方法，包含：ａ）提供样品，ｂ）使用ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３和２４的引物和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３的探针进行聚合酶链式反应扩增轻链，和／或ｃ）使用ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９和２１的引物和ＳＥＱ ＩＤＮＯ：４０的探针进行聚合酶链式反应扩增重链，和ｄ）用２．０的效率定量。具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２３和２４的引物分别结合在ＣＬ ２４７－２６６和ＣＬ１６６－１８５的位置，具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３的探针结合在人ＩｇＧ 链的１８９－２１２。ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１９的引物结合在ＣＨ ２区２２０－２３７位，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１的引物结合在ＣＨ ３区１１４－１３３位。最后，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０的引物结合在从ＣＨ２的３１５位到ＣＨ３的７位。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】免疫球蛋白编码核酸的测定本专利技术涉及免疫球蛋白编码核酸即RNA和DNA的测定方法，和用于免疫球蛋白编码核酸的PCR测定的引物。
技术介绍
目前的生物技术方法应用遗传工程改造的微生物以提供高产量的治疗多肽。在制备重组多肽特别是治疗免疫球蛋白中广泛使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。此细胞系能够提供翻译后修饰，最重要的，CHO细胞系能够将重组产生的多肽分泌至培养基， 使下游过程操作更加容易(Jiang, Ζ.，等人，Biotechnol. Prog. 22 (2006) 313-138 ；Yee, J. C.，等人，Biotechnol. Bioeng. 102(2009)246-263)。为了提高重组细胞系的生产率， 必须优化例如亲本细胞系、培养基或培养条件等参数Wee，J. C.，等人，Biotechnol. Bioeng. 102(2009)246-263)。基于对重组细胞系基因组中整合的异源核酸的位置、结构和拷贝数的分析，应当建立用于决定重组细胞系特性的指示物(Wurm，F. Μ.，Ann. N. Y. Acad. Sci. 782 (1996)70-78).编码异源多肽的核酸以脱氧核糖核酸(DNA)整合至重组细胞系的基因组，在转录过程中其被转录为核糖核酸(RNA)。在翻译过程中RNA又作为模板用于蛋白质的生物合成。由于RNA对基因表达的重要性，对此核酸的分析非常重要(kth，G.，等人， Biotechnol Bioeng. 97(2007)933-951)。在WO 2008/094871中报导了选择高产细胞系的方法。Chusainow，J.，等人 (Biotechnol. Bioeng. 102(2009) 1182-1196)报导了制备单克隆抗体的CHO细胞系的研究。 Barnes, L. Μ.，等人(Biotechnol. Bioeng. 85(2004) 115-121)报导了在重组 NSO 骨髓瘤细胞中蛋白质稳定表达的预测指示物的分子定义。专利技术概述本专利技术的一个方面为使用聚合酶链式反应和绝对定量测定编码IgGl或IgG4亚类的免疫球蛋白轻链和/或免疫球蛋白重链的mRNA的量的方法，通过a)对免疫球蛋白轻链进行聚合酶链式反应，使用SEQ ID NO 23和M的引物和具有FAM染料的TaqMan水解探针类型(format)的SEQ ID NO 33的探针，和/或b)对免疫球蛋白重链进行聚合酶链式反应，使用SEQ ID NO 19和21的引物和具有Cy5染料的I1aqMan水解探针类型的SEQ ID NO 40的探针，和C)进行效率为2. 0的绝对定量。本专利技术的另一个方面为包含SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24禾口 SEQ IDNO :33的核酸的第一个试剂盒和包含SEQ ID NO 19, SEQ ID NO :21和SEQ ID NO :40的核酸的第二个试剂盒。另一个方面为SEQ ID而23，对和33或SEQ ID NO 19，21和40的核酸在聚合酶链式反应中的用途。本专利技术的另一个方面为测定异源多肽表达细胞生产率的方法，其包含按以下顺序的以下步骤-在已知生产率的细胞中测定编码所述异源多肽的mRNA的量，-在未知生产率的细胞中测定编码所述异源多肽的mRNA的量，4-计算在所述未知生产率的细胞中和所述已知生产率的细胞中测定的编码所述异源多肽的mRNA量的比率，-将所述已知生产率细胞的生产率乘以所述计算的比率，由此测定异源多肽表达细胞的生产率。在一个实施方案中所述异源多肽为免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白缀合物。在另一个实施方案中对所述mRNA量的所述测定通过聚合酶链式反应(PCR)进行。在一个实施方案中mRNA量的测定通过使用SEQ ID NO 23和M的引物和具有FAM染料的TaqMan水解探针类型的SEQID NO :33的探针的聚合酶链式反应，和/或使用SEQ ID NO 19和21的引物和具有Cy5染料的I1aqMan水解探针类型的SEQ ID NO 40的探针的聚合酶链式反应。在另一个实施方案中编码所述异源免疫球蛋白的所述mRNA量为编码所述异源免疫球蛋白轻链的mRNA量和编码所述异源免疫球蛋白重链的mRNA量的平均值。在另一个实施方案中所述生产率为以Pg/细胞/天为单位的比生产率。在另一个实施方案中所述聚合酶链式反应为多重聚合酶链式反应。专利技术详述在本专利技术中发现编码免疫球蛋白的核酸(DNA)拷贝数和其产生的转录物(RNA)的量可用于测定表达异源免疫球蛋白的重组CHO细胞系的生产率。还发现编码异源多肽的 mRNA的量可用于测量所述细胞的比生产率。本专利技术包含测定免疫球蛋白表达细胞的生产率的方法，包含a)使用SEQ ID NO 23和M的引物和SEQ ID NO 33的探针进行聚合酶链式反应，和/或使用SEQ ID NO 19和21的引物和SEQ ID NO 40的探针进行聚合酶链式反应， 由此在已知生产率的细胞中测定编码免疫球蛋白的mRNA的量，b)使用SEQ ID NO 23和M的引物和SEQ ID NO 33的探针进行聚合酶链式反应，和/或使用SEQ ID NO 19和21的引物和SEQ ID NO 40的探针进行聚合酶链式反应， 由此在未知生产率的细胞中测定编码免疫球蛋白的mRNA的量，c)计算在未知生产率的细胞中和已知生产率的细胞中测定的编码免疫球蛋白的 mRNA量的比率，d)将已知生产率细胞的生产率乘以计算的比率，由此测定表达免疫球蛋白的细胞的生产率。对实施本专利技术有用的本领域技术人员已知的方法和技术描述于例如Ausubel， F. Μ. ,He, Current Protocols in Molecular Biology，I 至 III 卷(1997)，Wiley 和 Sons ; Sambrook,等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)。如本申请中使用的术语“氨基酸”指羧基α-氨基酸组，其可直接或以前体形式由核酸编码。单独的氨基酸由3个核苷酸组成的核酸编码，称为密码子或碱基三联体。每个氨基酸由至少1个密码子编码。将不同密码子编码相同的氨基酸称为“遗传密码的简并”。如本申请中使用的术语“氨基酸”指天然存在的羧基α-氨基酸，包含丙氨酸(3字母编码ala，单字母编码A)，精氨酸(arg，R)，天冬酰胺(asn，N)，天冬氨酸(asp，D)，半胱氨酸(cys，C)，谷氨酰胺(gln，Q)，谷氨酸(glu，E)，甘氨酸(gly，G)，组氨酸(his，H)，异亮氨酸(ile，I)，亮氨酸(leu，L)，赖氨酸(lys，K)，甲硫氨酸(met，M)，苯丙氨酸(phe，F)，脯氨酸(pro，P)，丝氨酸(s er，S)，苏氨酸(thr，T)，色氨酸(trp，W)，酪氨酸(tyr,Y)和缬氨酸 (val, V)。在此申请中可互换使用的术语“核酸”或“核酸序列”指由单个核苷酸(又称碱基) A、C、G和T (或在RNA中为U)组成的聚合分子，例如DNA、RNA或其修本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．测定ｍＲＮＡ量的方法，包含ａ）提供样品，ｂ）使用ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３和２４的引物和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３的探针进行聚合酶链式反应，和／或ｃ）使用ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９和２１的引物和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０的探针进行聚合酶链式反应，和ｄ）用２．０的效率定量。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：U·格普费特，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：CH
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