多能干细胞的分化制造技术

本发明专利技术涉及使多能干细胞分化的方法。具体来讲，本发明专利技术涉及使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法和组合物。本发明专利技术还提供了产生和纯化能使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的试剂的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多能干细胞的分化本专利技术要求于2008年6月30日提交的申请系列号61/076,889的优先权。
本专利技术涉及使多能干细胞分化的方法。具体来讲，本专利技术涉及使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法和组合物。本专利技术还提供了产生和纯化能使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的试剂的方法。
技术介绍
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞，例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群体。诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞表达多种标志物，例如，HNF-3β、GATA4、MIXL1、CXCR4和SOX17。定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰-十二指肠同源盒基因Pdx1。在不存在Pdx1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，Pdx1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰腺内胚层的分化。据报道，从小鼠的胚胎细胞衍生了带有胰岛细胞特征的细胞。例如，Lumelsky等人(Science292：1389，2001)报道了小鼠胚胎干细胞向类似胰岛的胰岛素分泌结构的分化。Soria等人(Diabetes49：157，2000)报道，衍生自小鼠胚胎干细胞的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠中的血糖变正常。例如，Hori等人(PNAS99：16105，2002)揭示，用磷酸肌醇3-激酶(LY294002)的抑制剂处理小鼠胚胎干细胞产生了类似β细胞的细胞。又如，Blyszczuk等人(PNAS100：998，2003)报道，从组成型表达Pax4的小鼠胚胎干细胞产生了胰岛素生成细胞。Micallef等人报道说，视黄酸可调节胚胎干细胞定向形成Pdx1阳性胰腺内胚层。在对应于胚胎的原肠胚形成末的期间，加入胚胎干细胞分化第4天的培养物中时视黄酸是诱导Pdx1最有效的(Diabetes54：301，2005)。Miyazaki等人报道了过表达Pdx1的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果显示，外源Pdx1表达在所得的分化细胞中明显增强了胰岛素、生长抑素、葡萄糖激酶、神经元素3、P48、Pax6和HNF6基因的表达(Diabetes53：1030，2004)。Skoudy等人报道说，激活素A(TGF-β超家族的成员)能上调小鼠胚胎干细胞中的胰腺外分泌基因(p48和淀粉酶)和内分泌基因(Pdx1、胰岛素和胰高血糖素)的表达。使用1nM激活素A时观察到最大的效果。他们还观察到，胰岛素和Pdx1mRNA的表达水平不受视黄酸的影响；然而，3nMFGF7处理导致Pdx1的转录水平升高(Biochem.J.379：749，2004)。Shiraki等人研究了特别地增强胚胎干细胞分化为Pdx1阳性细胞的生长因子的效应。他们观察到，TGFβ2可再现地产生更高比例的PDX1阳性细胞(GenesCells.2005年6月；10(6)：503-16)。Gordon等人阐明了在不存在血清的情况下和在存在激活素连同Wnt信号转导抑制剂的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导brachyury[阳性]/HNF-3β[阳性]内胚层细胞(US2006/0003446A1)。Gordon等人(PNAS，第103卷，第16806页，2006年)声称：“Wnt和TGFβ/nodal/激活素信号转导同时为前原条的产生所必需”。然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物(例如人)中的发育程序。Thomson等人从人胚泡分离了胚胎干细胞(Science282：114，1998)。同时，Gearhart和其同事从胎儿生殖腺组织衍生了人胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：13726，1998)。与可简单通过与白血病抑制因子(LIF)一起培养来防止分化的小鼠胚胎干细胞不一样，人胚胎干细胞必须维持在非常特殊的条件下(美国专利No.6,200,806、WO99/20741、WO01/51616)。D′Amour等人描述了在高浓度激活素和低血清的存在下生产人胚胎干细胞衍生定形内胚层的富集培养基(D′AmourKA等人，2005)。将这些细胞移植到小鼠的肾囊下，导致分化成具有某些内胚层器官的特性的更成熟细胞。在加入FGF-10之后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞可进一步分化成Pdx1阳性细胞(US2005/0266554A1)。D′Amour等人(NatureBiotechnology-24，1392-1401(2006))声称：“我们已开发出使人胚胎干(hES)细胞转化成能够合成胰腺激素胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽和生长激素释放肽的内分泌细胞的分化方法。该方法通过引导细胞经过类似于定形内胚层、肠管内胚层、胰腺内胚层和内分泌前体的阶段转变为表达内分泌激素的细胞来模拟体内胰腺器官发生”。又如，Fisk等人报道了用于从人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统(US2006/0040387A1)。在该情形中，分化途径分成三个阶段。首先，使用正丁酸盐和激活素A的组合，使人胚胎干细胞分化为内胚层。然后将细胞与TGFβ拮抗剂如Noggin并结合EGF或β细胞素(betacellulin)一起进行培养，以产生Pdx1阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。在一个例子中，Benvenistry等人声称：“我们得出如下结论：PDX1的过量表达增强了胰富集基因的表达，胰岛素表达的诱导可能需要仅存在于体内的额外的信号(Benvenistry等人，StemCells2006；24：1923-1930)。激活素A是表现出广泛生物活性的TGF-β家族成员，所述生物活性包括调控细胞增殖和分化以及促进神经元存活。激活素A是由两个激活素βA亚基组成的同型二聚体，其由抑制素(inhibin)A基因编码。其他激活素已知是由βA、βC、βD和βE的同型二聚体或异型二聚体组成的。例如，激活素B由两个βB亚基的同型二聚体组成。包含βA亚基和βB亚基的肽具有63％的同一性，并且八个半胱氨酸的位置在这两种肽序列中均是保守的。激活素A通过与受体结合而对细胞施加其影响。所述受体由异聚受体复合物组成，该复合物由两种类型的受体(I型(ActR-I)和II型(ActR-II))组成，每一种含有细胞内的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。这些受体在结构上与小的富半胱氨酸细胞外区域和由激酶结构域构成的细胞内区域相似。ActR-I(但ActR-II不是)在近膜结构域中具有富含甘氨酸和丝氨酸残基的区域(GS结构域)。激活素A首先与ActR-II结合，后者以与组成性活性激酶形成的低聚体形式存在于细胞膜中。在缺乏ActR-II的情况下，ActR-I(其也作为低聚体形式存在)不能结合激活素A。在激活素A结合后，ActR-I被募集与ActR-II形成复合物。ActR-本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，所述方法包括用培养基处理所述多能干细胞，持续足以使所述多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的一段时间，所述培养基含有肽，所述肽包含含有至少一个点突变的激活素Ａ的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US61/0768892008年6月30日1.一种使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，所述方法包括用含有激活素A的培养基处理所述多能干细胞，持续足以使所述多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的一段时间，其中所述多能干细胞为确立的多能干细胞系，以及其中所述激活素A是ACTN4，其序列示于SEQIDNO：5；ACTN48，其序列示于SEQIDNO：49；ACTN11，其序列示于SEQIDNO：12；ACTN34，其序列示于SEQIDNO：35；ACTN29，其序列示于SEQIDNO：...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·戴维斯，
申请(专利权)人：森托科尔奥索生物科技公司，
类型：发明
国别省市：US